肾上腺皮质激素氢化可的松(皮质醇Cor)是维持生命的必需激素,体内含量的多少对物质代谢,血管反应,神经系统,免疫功能及炎症反应有不同程度的影响。肾上腺皮质激素水平低下,人体对外来损伤性刺激或剧烈环境变化的适应能力将大大降低。在精神生物学研究中,氢化可的松是一种非常重要的激素,它被称为“压力荷尔蒙”,人体面临生理、心理刺激时其分泌量增高(应激反应)。受检测方法限制,目前多采用血液Cor作为检测指标,然而采血样,本身是一种急性应激源,亦可能造成血液Cor上升。唾液Cor(SF)无创性的采样避免抽血应激,此外可频繁多次收集,病人可在家中自行留取样本,尤其适用于儿童,能够反映血清游离Cor(FF)水平,大量研究表明SF/FF的比值约为0.5,并且SF值与FF值呈高度相关,所以采用唾液CorSF)作为检测指标更加能反映实际情况,检测结果也更为可靠。 本文在以下三个方面进行了研究：(1)对唾液样本中氢化可的松的提取方法及氢化可的松硫酸衍生产物的提取方法进行研究；(2)建立灵敏准确地测定唾液中氢化可的松的方法；(3)生物样本的测定,考察唾液氢化可的松测定法在儿童心理应激研究中应用的可行性。 本课题的研究将为精神生物学、脑科学以及疾病诊断等研究提供一种研究手段。 论文主要工作如下： 一、生物样本中目标物前处理方法的研究 采用本实验室研究的几种纳米纤维作为固相萃取柱的吸附剂,研究了水基质中的六种甾体化合物的提取效率,并在此基础上选择提取效率较高的聚苯乙烯(PS10％)电纺纳米纤维作为吸附剂研究了唾液样本中氢化可的松和醋酸可的松的提取情况。 唾液氢化可的松测定法中需要两次提取过程,本论文成功的在二次提取过程中以聚苯乙烯(PS10％)电纺纳米纤维为萃取介质填装固相微萃取小柱,取代文献传统的溶剂提取法,提取强酸衍生液中的目标物,提取同收效率可达100％。解决了常规提取方法提取回收率低、净化效果差的缺点,不仅使得检测灵敏度增高、干扰减少,而且提取过程简便、快速、环保。 二、建立柱前衍生化-高效液相色谱法测定氢化可的松的方法及其评价 氢化可的松本身具有紫外吸收,可以直接用紫外检测器检测,但是由于唾液样本中氢化可的松的含量比血液及尿液中的含量低约两个数量级,早晨的含量约为1.0-8.0ng/mL,夜晚则更低只有0.0-1.0ng/mL左右。而紫外检测法的检出限不足以达到唾液中氢化可的松含量检测的要求,所以采用紫外检测法来定量分析唾液样本比较困难。因此选用柱前衍生试剂--硫酸/乙醇溶液,先将氢化可的松衍生为具有较强荧光强度的衍生物,然后通过测定氢化可的松衍生产物的荧光强度对氢化可的松进行定量分析。本文建立了准确的、灵敏的测定唾液中氢化可的松的高效液相色谱法。色谱柱为迪马C18(4.6×250mm,5um),硫酸/乙醇溶液为柱前衍生试剂,流速为1.0mL/min,荧光检测器检测。氢化可的松在0.01～20ng/mL范围内,线性关系良好(r=0.9991),本方法简便、快速、准确,可用于唾液中氢化可的松的测定。 三、氢化可的松衍生产物结构质谱分析 通过液相制备氢化可的松两个硫酸衍生产物的单体,经质谱仪分析得到两个衍生产物中质谱丰度较高的碎片离子峰,结合参考文献的研究,初步推断了两个衍生产物的衍生过程。二号衍生产物的衍生过程与文献报道的一致,一号衍生产物经历了磺酸化的过程,此研究发现尚未见文献报道。 四、唾液氢化可的松测定法在儿童心理应激试验中应用可行性初步研究 为验证唾液氢化可的松测定法在儿童心理应激试验中应用的可行性,用建立的检测方法测定了正常人和心理试验中被试儿童的的唾液样本氢化可的松含量,正常人测定结果在0.85～2.76ng/mL,与文献报道的小于80.ng/mL相符合。测定了被试儿童的三十例唾液样本,发现刺激前后的氢化可的松的含量有变化。