乳链菌肽抗性蛋白(NSR)突变体在大肠杆菌中的表达纯化及功能研究

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乳链菌肽(Nisin)是某些乳酸菌产生的一种阳离子抗菌肽,而Nisin抗性蛋白(Nisin resistance protein,NSR)的表达则使一些非Nisin产生菌获得Nisin抗性。本实验室前期研究结果表明,作为乳酸乳球菌中第一个被鉴定的末端特异性蛋白酶,NSR是通过降解Nisin使其抑菌活性降低来行使Nisin抗性功能的,其降解位点在Nisin分子的MeLan28(Methyllanthionine,甲基羊毛硫氨酸)和Ser29之间。在此研究基础上,本文进一步对NSR蛋白的结构与功能关系,包括其核心功能区降解Nisin活性及与底物Nisin的结合能力等进行了研究,为深入了解和阐明NSR作为一种末端特异性蛋白酶行使Nisin抗性的作用机制奠定基础。本研究首先是确定NSR行使体外降解Nisin功能的核心功能区域。在对NSR蛋白进行同源序列分析以及二级结构、三级结构比对的基础上,构建了不同结构域缺失的NSR与谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase, GST)的融合表达载体NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67、NSR△38,并转化大肠杆菌E. coli BL21。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析显示各表达产物均以部分可溶形式存在。经过谷胱甘肽(GSH)亲和柱层析、PreScission蛋白酶切后最终获得电泳纯的NSR不同结构域缺失突变体蛋白。进而通过体外反应系统,检测了各突变体体外降解Nisin的生物功能。反应产物抑菌活性测定结果表明被NSRΔ38作用后的Nisin丧失了抑菌活性,而被NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67作用后的Nisin没有丧失抑菌活性;反相高效液相层析(RP-HPLC)分析结果进一步表明这是由NSRΔ38具备Nisin降解活性所造成的,而突变体NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67则不具备Nisin降解活性。为进一步分析NSR不同功能区识别结合底物Nisin的能力,采用相同策略,分别构建了NSR△94、NSR△78、NSR△67、NSR△38第236位丝氨酸突变的截短突变体,并在大肠杆菌中实现了GST融合表达,经过GSH柱层析、PreScission蛋白酶切后获得电泳纯不具降解活性的突变体蛋白。利用表面等离子共振技术(SPR)分别检测了NSRS△27、NSRS△38、NSRS△94突变体在体外对Nisin的结合能力,结果显示NSRS△38、NSRS△94两个突变体结合Nisin的Kd值相同,而NSRS△27结合Nisin的Kd值比NSRS△38及NSRS△94的Kd值高一个数量级,表明了其更强的底物结合能力。
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