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全面了解蛋白质的翻译后修饰是以染色体为中心的人类蛋白质组计划(ChromosomeCentric Human Proteome Project,C-HPP)的主要目标之一。已知外泌体(exosome)可携带磷酸化蛋白质,并在肿瘤微环境中扮演重要角色。但由于大量外泌体提纯、微量磷酸化肽段富集等难题,尚未见外泌体磷酸化蛋白质组的报道。我们认为外泌体中可能存在人类新的磷酸化蛋白质形式。本研究中,我们实现了高纯度SW620外泌体的大量提取,优化了微量磷酸化蛋白质组的质谱分析。我们整合了磷酸化位点数据库dbPTM、PhosphoSitePlus?和SubPhosDB,得到包含42,143个蛋白质(及其变体)和184,804个磷酸化位点的多磷酸化蛋白质数据库。以该数据库为参照,经严格的数据质控,共鉴定到高可信度的313个SW620外泌体磷酸化蛋白质及其上的924个磷酸化位点,其中202个为新磷酸化位点。我们发现外泌体磷酸化蛋白质显著富集于11号染色体,与细胞磷酸化蛋白质具显著不同的染色体分布特征。另外,SW620外泌体的酪氨酸(Y)-磷酸化位点占6.4%,高于细胞组分10倍以上;进而,我们以HCT116细胞为验证,得到相同趋势。通路分析表明,外泌体Y-磷酸化蛋白质不仅显著调控外泌体的生命周期,并可显著调控ephrin通路引导的细胞骨架重塑及细胞紧密连接。综上,本研究报道了首个高覆盖度的人细胞外泌体磷酸化蛋白质组,提供符合C-HPP标准的高可信的新磷酸化位点和蛋白质磷酸化形式。本研究证明了外泌体是重要的磷酸化信号转运者,并可携带人类新磷酸化蛋白质。