【摘 要】
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背景:皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous Squamous Cell Carcinoma,c SCC）是一种常见恶性肿瘤,恶性程度高、易转移,其病因及发病机制尚不明确,因此有必要对c SCC的病因及发病机制进行进一步研究。此前,课题组通过研究发现,PPP3CB基因在c SCC组织较癌旁组织表达降低,因此我们推测其可能为抑癌基因,为进行进一步验证,本研究拟采用基因过表达技术对PPP3CB在人皮肤鳞状
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背景:皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous Squamous Cell Carcinoma,c SCC）是一种常见恶性肿瘤,恶性程度高、易转移,其病因及发病机制尚不明确,因此有必要对c SCC的病因及发病机制进行进一步研究。此前,课题组通过研究发现,PPP3CB基因在c SCC组织较癌旁组织表达降低,因此我们推测其可能为抑癌基因,为进行进一步验证,本研究拟采用基因过表达技术对PPP3CB在人皮肤鳞状细胞癌Colo16与A431细胞中的功能进行初步探索。目的:研究上调PPP3CB基因对人皮肤鳞状细胞癌细胞系Colo16与A431细胞生物学行为的影响。方法:1.构建目的基因过表达慢病毒载体,包装及滴度测定。2.使用过表达慢病毒构建人皮肤鳞状细胞癌细胞系Colo16和A431稳转细胞株。细胞系各分为三组,Colo16-control与A431-control:未转染目的基因空白组;Colo16-Lv-control与A431-Lv-control:转染空载体阴性对照组;Colo16-Lv-PPP3CB与A431-Lv-PPP3CB:转染PPP3CB基因实验组。3.利用qPCR分别检测Colo16与A431细胞系中PPP3CB mRNA的表达。4.利用Western Blot分别检测Colo16与A431细胞系中PPP3CB蛋白表达。5.利用CCK-8试剂盒检测Colo16与A431细胞系细胞增殖能力强弱。6.利用细胞划痕实验分别检测Colo16与A431细胞系细胞迁移能力。7.利用Transwell细胞侵袭实验检测Colo16与A431细胞系细胞侵袭能力。结果:1.过表达慢病毒滴度分别为:LV-PPP3CB=3×10~8TU/ML,LV-control=1×10~9TU/ML。慢病毒转染Colo16细胞最佳MOI值为60,最佳嘌呤霉素浓度为2ug/ml;慢病毒转染A431细胞最佳MOI值为120,最佳嘌呤霉素浓度为3ug/ml。2.qPCR检测Colo16与A431细胞系PPP3CB mRNA表达,阴性对照组较空白组无明显差异（P＞0.05）,实验组较空白组显著增高（Colo16:F=275.4,P＜0.05;A431:F=344.4,P＜0.05）。Western Blot检测PPP3CB蛋白表达,阴性对照组较空白组无明显差异（P＞0.05）,实验组较空白组显著增高（Colo16:F=49.9,P＜0.05;A431:F=74.6,P＜0.05）。3.CCK8结果显示:阴性对照组增值能力较空白组无明显差异,实验组增值能力较空白组能力明显减弱(Colo16:F时间=4021.9,F组别=341.5,F时间×组别=83.7,P＜0.05;A431:F时间=1020.8,F组别=149.2,F时间×组别=47.2,P＜0.05);划痕实验结果显示:阴性对照组细胞迁移能力较空白组无明显差异,实验组细胞迁移能力较空白组能力明显减弱（Colo16:F=257.4,P＜0.05;A431:F=1412.6,P＜0.05）;Transwell结果显示:阴性对照组侵袭能力较空白组无明显差异,实验组侵袭能力较空白组能力明显减弱（Colo16:F=253.0,P＜0.05;A431:F=1070.3,P＜0.05）。结论:PPP3CB基因可以抑制Colo16与A431细胞增殖、迁移和侵袭能力,可能发挥抑癌基因的作用,但是其抑癌基因的功能与机制仍需要进一步研究。
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