副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)为格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)病原,定殖于猪上呼吸道,该菌可引发以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的系统性疾病。Dsb A为二硫键氧化还原酶,参与催化蛋白二硫键的折叠,通过影响蛋白的高级结构而影响蛋白的活性和功能,细菌能编码不同数量和不同类型的Dsb A同系物。副猪嗜血杆菌中存在两个Dsb A,Dsb A1与E.coli K-12的Dsb A氨基酸一致性为47%,Dsb A2与Ec Dsb A不具有氨基酸相似性,两者的功能尚未见任何文献报道,其在副猪嗜血杆菌中的作用有待研究。本课题试图构建副猪嗜血杆菌SH0165菌株Δdsb A基因缺失株和互补菌株,通过生化特性分析和基因功能的初步研究探索Dsb A在副猪嗜血杆菌中所发挥的作用。具体过程如下:1、dsb A基因缺失株和互补菌株的构建首先,以SH0165基因组为模板PCR扩增dsb A1和dsb A2基因的上下游同源臂,并以p SHK3和p AT18质粒为模板分别扩增kan片段和erm片段,通过重叠PCR将同源臂与对应的抗性片段重叠连接,分别克隆至自杀性质粒p K18和穿梭质粒p SHK3中,成功构建了p K18-dsb A1-UKD、p K18-dsb A2-UED、p SHK3-dsb A1-UKD、p SHK3-dsb A2-UED重组质粒,最终由自然转化成功获得Δdsb A1和Δdsb A2基因缺失株。其次,本课题将dsb A1编码序列及其上游启动子和下游终止子序列克隆至p SHK3穿梭载体构建p SHK3-C-dsb A1质粒,p SHK3-C-dsb A1经体外甲基化后电转入Δdsb A1中成功获得互补菌株。2、Dsb A1和Dsb A2生化特性研究首先,测定SH0165、Δdsb A1和Δdsb A2各菌株在不同Cu Cl2浓度(0~10m M)OD600的变化情况,在菌体内检测Dsb A1和Dsb A2的异构酶活性。结果显示SH0165、Δdsb A1和Δdsb A2的OD600随着铜离子浓度的增加不断减小,但减小趋势一致,即各菌株对铜的敏感程度一致。推测Dsb A1和Dsb A2均不是二硫键还原/异构酶,不能异构由铜造成的蛋白的错误折叠。其次,在p ET28a载体中构建Dsb A1、Dsb A2和Trx A(阳性对照)原核表达重组质粒,表达并纯化,纯化的蛋白用于胰岛素还原实验。结果显示异构酶Trx A(还原酶)、Dsb A1和Dsb A2均能催化DTT对胰岛素的还原作用,Dsb A1和Dsb A2催化速率低于异构酶Trx A,出现了20min的滞后。证实Dsb A1和Dsb A2不是二硫键异构酶。最后,测定SH0165、Δdsb A1和Δdsb A2菌株在1m M DTT浓度下的存活情况。结果显示SH0165和Δdsb A2对DTT的敏感程度一致,而Δdsb A1显著比SH0165和Δdsb A2对DTT更敏感。推测Dsb A1是二硫键氧化折叠酶能抵抗DTT的还原作用。3、dsb A1缺失对SH0165生长的影响绘制SH0165、Δdsb A1和C-dsb A1的生长曲线初步探究dsb A1是否对菌株生长产生影响。结果表明当缺失dsb A1基因后,Δdsb A1的OD600值和活菌量均显著低于SH0165,而dsb A1基因互补后,缺失株的生长表型得到了部分提高。可知dsb A1的缺失影响了SH0165的生长。通过扫描电镜进一步观察dsb A1缺失对生长的影响。本研究选取平板培养至6h、12h和24h的SH0165和Δdsb A1菌苔观察菌体形态。比较发现,在6h和12h时Δdsb A1部分细菌形态明显变长,而在24h时得到恢复。推测dsb A1缺失影响细菌分裂导致生长滞后。铁螯合生长实验初步探究dsb A1影响SH0165生长的机制。本实验加入不同浓度的Dip(250μM和300μM)螯合铁源,检测各菌株在铁限制环境下的生长情况。结果显示:在相同Dip浓度下,Δdsb A1的存活情况明显弱于SH0165,dsb A1缺失影响菌株在铁限制环境下的生长。4、dsb A1其它功能研究本课题通过血清抗性实验探究dsb A1在副猪嗜血杆菌中的作用。选取90%的猪血清与SH0165、Δdsb A1和C-dsb A1相互作用,结果表明当dsb A1缺失后菌株存活能力显著下降,抵抗血清中补体的溶菌作用减弱。