本研究分为两部分工作,前三章内容以典型的自身免疫性疾病--系统性红斑狼疮为研究背景,研究了雌二醇和间充质干细胞对B淋巴细胞的调节；最后两章为IL-12基因免疫治疗肿瘤的研究。一、雌二醇可通过TLR9信号增强B细胞的状态和功能系统性红斑狼疮(SLE)是一种以大量产生抗核酸抗原抗体为特征的典型自身性免疫疾病,SLE患者体内抗双链DNA (dsDNA)抗体的水平上升尤为显著。B细胞被认为在SLE发病过程中发挥着非常重要的作用,因为B细胞不但是产生抗体的专职细胞,还能分泌许多和炎症相关的因子,并具有递呈抗原的能力。另外,SLE患者中女性的比例大大高于男性,女性患者的病情会随着月经周期和孕期雌激素水平的变化和改变。小鼠疾病模型显示雌激素可加重病情发展,应用雌激素类避孕药也会致病情加重。种种证据表明,雌激素是造成SLE这一性别偏向的重要原因。17β-雌二醇(E2)是人体最为主要的一种雌激素,B细胞具有E2受体,有报道指出,雌二醇可以影响B细胞的凋亡、活化和功能变化,并提示其通过调节B细胞内的分子信号加重SLE病程,但是具体作用机制不明。B细胞内表达Toll样受体9(TLR9),TLR9可以识别双链DNA,在免疫识别和调节上起着重要作用。基因敲除B细胞上的TLR9,小鼠无法产生抗dsDNA抗体,因而TLR9在SLE发病机制中至关重要。然而,雌激素和B细胞内的TLR9这两者之间存在何种关联,仍有待我们研究。因此,我们研究了在TLR9激动剂CpG寡核苷酸(CpG-ODN)的刺激下,雌二醇对小鼠脾脏B淋巴细胞的作用。首先在体外实验中,我们用阴选免疫磁珠法分离纯化获得小鼠脾脏初始成熟B细胞,然后用雌二醇和CpG分别或共同刺激B细胞。我们发现,刺激24小时后,B细胞的形态发生了明显变化。我们对B细胞生长和功能两方面进行了研究,通过CCK-8法检测细胞活力、活细胞计数、CFSE标记法检测增殖、Annexin-PI双染法检测凋亡；流式细胞仪检测细胞表面共刺激分子和内部细胞因子的表达水平,ELISA(酶联免疫吸附测定)法检测抗体水平。我们发现,CpG可以促使B细胞的增殖和活化,而雌激素和CpG共同作用,比CpG单独作用,更加能够促进B细胞的生长(活力,存活)、表面分子活化(共刺激分子CD40和CD86的表达上调)和IgM抗体的分泌,而雌激素单独作用并未能引起以上变化。进一步的,我们为了研究体内雌二醇和CpG对脾脏B细胞的作用,建立了小鼠模型。我们将4-6周大的Balb/c小鼠分为6组,其中一组作为对照组,一组进行假手术(Sham),其余4组进行去卵巢手术(Ovx)。待小鼠恢复两周后,连续向去卵巢的小鼠分别皮下注射雌二醇、CpG和同时注射两者(E2+CpG)两周,然后检测小鼠脾脏淋巴细胞的情况和血清中抗体的水平。结果显示,各组小鼠脾脏中B细胞的比例没有发生变化,我们用CD19+/B220+圈出B细胞群(圈门),再对门内的B细胞进行分析。与体内实验类似,雌二醇能协同CpG,促进脾脏B细胞上表面共刺激分子CD40的表达,协同增强小鼠血清中IgM的水平。体内实验不同于体外实验的是,雌二醇单独作用对B细胞的活化也起到增进效果,这提示体内雌二醇对B细胞的调控比体外更为复杂。另外,在体内,雌二醇还可增强B细胞内IL-6,IL-10,IL-12等与自身免疫病发病相关的细胞因子的表达。为了更加了解雌二醇对TLR9信号通路的调控机制,我们首先检测了雌二醇对TLR9的直接作用。结果发现,无论在体内还是体外实验,雌激素均可上调B细胞内TLR9分子的表达。为了寻找雌二醇作用于TLR9信号通路的具体分子,我们又通过全基因组基因芯片分析了雌二醇影响B细胞的基因表达情况。我们发现,雌二醇可上调微小染色体维持蛋白6(MCM6)分子的表达,而在雌激素和CpG共同作用下,MCM6的mRNA水平上升更为显著。MCM家族的分子主要通过形成多聚体参与细胞复制,但近来也有报道其成员单独作用可调控转录因子。继而在体内实验中,我们验证了雌二醇联合CpG上调了B细胞内MCM6的表达,提示MCM6参与了雌二醇对TLR9信号的调控。综合以上实验结果显示,雌二醇可以通过增强小鼠脾脏B细胞内TLR9信号,加强TLR9配体对B细胞状态和功能上的活化。此部分工作证实了雌二醇联合TLR9激动剂对B细胞的调控作用,并为探明SLE中雌激素调节B细胞功能的机制提供了新的研究方向。二、间充质干细胞可抑制B细胞的细胞周期、表面共刺激分子和免疫球蛋白的表达,而促进B细胞细胞因子的表达除了雌激素,间充质干细胞(MSCs)也被认为对SLE中B细胞的活化有着重要调节作用。间充质干细胞因为其具有多向分化潜能、低免疫原性和免疫调节的特性,而被视为一种有效治疗自身免疫疾病和癌症的潜在手段。在SLE小鼠疾病模型和临床试验中,脐带组织来源的间充质干细胞(UC-MSCs)显示了良好的治疗效果。尽管许多研究已经证明了间充质干细胞对T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞均有一定的免疫抑制作用,但间充质干细胞对B细胞的研究却很少,而且存在一定的矛盾,作用机制不明。我们以三种人来源的非霍奇金淋巴瘤细胞系Daudi,Namalwa和Raji细胞作为B细胞模型,这三种细胞上都高表达TLR9,免疫球蛋白类表达IgM。我们首先研究了在CpG刺激和不刺激下,脐带间充质干细胞对B细胞系的细胞周期、凋亡、增殖、表面共刺激分子和IgM表达的调控情况。我们发现,MSC阻滞Namalwa和Raji细胞的细胞周期,而对细胞的凋亡均没有明显影响。间充质干细胞抑制所有三种B细胞上共刺激分子CD86的表达, Daudi和Namalwa细胞表面IgM的表达,和Raji细胞表面共刺激分子CD40的表达。接下来,我们研究了间充质干细胞对B细胞的抑制作用是否需要细胞与细胞间的接触作用。根据小室实验的结果显示,MSC对Daudi细胞上CD86表达的抑制是通过可溶分泌物作用的。间充质干细胞可以分泌多种具有免疫调节功能的细胞因子和物质,其中环氧化物酶2(COX2)是一种重要的分泌物。我们在共培体系中加入COX2的抑制剂吲哚美辛,结果显示间充质干细胞对CD86的抑制作用不受COX2抑制剂的影响,说明COX2不是产生此效应的主要因子。由于有报道指出不同细胞比例可能会影响间充质干细胞对淋巴细胞作用的结果,我们还用1：1和1：10不同比例混合培养间充质干细胞和Daudi,结果显示两种细胞比例都可以起到抑制作用。为了进一步了解间充质干细胞对B细胞分泌免疫调节因子的影响,我们用定量PCR检测了B细胞内多种相关因子的mRNA水平。结果显示,MSC能够持续上调Daudi细胞内CCL2, COX-2, IL-6, IL-8, CXCL1mRNA的表达,但不影响促炎症因子TNF-α的表达。由于间充质干细胞对免疫细胞发挥作用往往需要通过IFN-γ, IL-1β等炎症因子的激发,而IL-1β在SLE中也有重要作用,我们用IL-1β预处理MSC24小时,然后再和Daudi细胞共培。结果显示,经过IL-1β预处理的间充质干细胞表达CCL2、CCL5、CXCL1、COX2、IL-6、IL-8的水平都显著上升,TGF-β、SDF-1、IL-10的表达没有明显变化。而将IL-1β预处理的MSC和Daudi细胞共培,不但可以更加促进以上细胞因子在Daudi的表达,还诱导了抗炎症因子IL-10的表达上调。在了解了MSC对B细胞系的以上作用后,我们考虑间充质干细胞是如何作用于B细胞系的?通过影响了B细胞系内的什么信号途径?为此,我们用Western Blot检测了三种B细胞与MSC共培后,B细胞系内与细胞因子和细胞外分泌物调控相关的PI3K, STAT、MAPK通路上信号分子的蛋白水平。研究显示,与间充质干细胞作用后,三种细胞系内的ERK信号均被持续激活,而其它通路没有发现显著变化。为了进一步证明ERK通路的活化参与了MSC对B细胞系功能的调节,我们用ERK的特异性抑制剂U0126预处理Daudi细胞,或在共培养体系中加入ERK抑制剂,结果显示MSC对Daudi表面IgM、CD86表达的抑制作用和对CCL2的促进作用都受到一定的减弱,说明MSC确实通过影响B细胞系的ERK通路抑制其部分功能。综上所述,MSC对人B细胞系有一定的免疫抑制性作用,包括对细胞周期、表面共刺激分子和免疫球蛋白表达的抑制,以及促进B细胞系产生免疫调节物。这种效应可以通过间充质干细胞分泌免疫调节物,作用于B细胞系的ERK通路而进行。此部分工作为研究MSC对人B细胞的作用提供了一个良好的研究模型,为以后更深入地探MSC如何调控原代B细胞以及寻找效应分子提供了工作基础。三、IL,-12基因转导可有效治疗肿瘤目前,基因免疫治疗是一种新型的治疗肿瘤的方式。白细胞介素-12(IL-12)是启动Thl反应的的关键细胞因子,并有作为抗肿瘤药物的研究价值。然而,IL-12治疗肿瘤的临床试验并不成功,主要是由于IL-12会引起毒副作用。为了解决这个问题,我们使用慢病毒载体转导的肿瘤细胞系,作为自体肿瘤细胞疫苗注射。此研究的重点为,在实体瘤如鳞状细胞癌(SCC)模型上测试这种方法的疗效。我们将IL-12基因通过慢病毒导入小鼠鳞状细胞癌细胞系sccⅦ,然后筛选出分泌不同浓度IL-12的细胞克隆。向小鼠身体一侧分别皮下注射初始SCCⅦ细胞和分泌IL-12的SCC细胞(IL-12SCC),结果显示SCCⅦ在小鼠体内形成肿瘤,而IL-12SCC并没有。这一说明,分泌IL-12的SCC细胞可以被机体识别并清除。进一步,我们研究了T细胞是否参与了机体对肿瘤细胞的识别和清除,又能引起哪类T细胞免疫应答呢?为此,我们进行了去除T细胞的实验：在第-14,-1,3,7,14,21天分别注射抗CD4的抗体、抗CD8的抗体和同时注射两种抗体,使得小鼠体内CD4+T细胞或CD8+T细胞,或两种T细胞都得到有效清除。在此情况下,第0天注射IL-12SCC和SCCⅦ,,然后监测机体对IL-12SCC清除的情况。实验显示,去除了两种T细胞中的任何一种,IL-12SCC都能在体内形成肿瘤,这说明CD4+T细胞和CD8+T细胞都是机体有效清除SCC细胞所必须的。那么,分泌IL-12的SCC细胞是否能引起体内长时效的记忆性免疫应答呢?为了研究清楚这一点,我们首先用分泌IL-12的SCC分别通过局部性的皮下注射和系统性的腹腔注射方式接种／免疫小鼠,再分别在50天后和再次间隔70天后,在小鼠接种“疫苗肿瘤”的同侧或异侧皮下注射初始肿瘤细胞SCCⅦ。结果显示,经过两次初始肿瘤细胞SCCⅦ的挑战,几乎所有接种过IL-12SCC细胞的小鼠体内都没用肿瘤形成,说明IL-12SCC在小鼠体内引发了长期而有效的记忆性免疫。我们之前的研究提示,提高肿瘤局部IL-12的浓度而降低IL-12的总浓度,可能对激发机体识别并清除肿瘤的免疫反应更为有效,而引起的毒副作用更小。因此,我们将分泌IL-12的SCC和初始SCCⅦ按一定比例混合后,同时注入小鼠体内,发现也能有效抑制肿瘤的生长。更为有趣的是,当注射入小鼠体内的细胞中产生IL-12的总水平相当时,即一组为仅含有很小一部分能分泌高浓度IL-12的SCC的混合细胞；另一组为含有较高比例能够分泌IL-12的SCC,但是单个分泌IL-12浓度较低的混合细胞,两组相比较,前者对肿瘤的抑制效果要好很多。这说明肿瘤周围IL-12的局部浓度非常关键,只有当局部IL-12浓度达到一定水平,才能激发机体对肿瘤的免疫反应。另外,我们在SCC IL-12抑制肿瘤生长的过程中,于不同时间采取了小鼠血清,通过CBA液相多重蛋白定量技术检测了小鼠血清中炎症相关因子的水平。结果显示,和正常SCCVII相比,注射分泌IL-12的SCC的小鼠体内并没有大量分泌IL-6,IL-10,IL-12和MCP-1等细胞因子,促炎症因子IFN-γ和TNF-α的水平也低于检测值。总之,此项研究显示IL-12基因转导肿瘤细胞,是一条有效免疫治疗肿瘤的策略。