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胁迫可导致内质网（Endoplasmic reticulum,ER）中堆积大量异常折叠或未折叠蛋白,造成内质网胁迫（ER stress）,细胞感受到胁迫压力会激活未折叠蛋白信号通路（Unfolded protein response,UPR）重建内质网稳态,但胁迫过强超过细胞修复能力时就会诱导程序性细胞死亡（Programmed cell death,PCD）发生。动物细胞中抗凋亡因子BI-1与UPR受体IRE1互作抑制PCD,而拟南芥BI-1可以通过Cb5介导与脂肪酸2-羟基化酶FAH互作调控PCD,还可以通过直接与自噬元件ATG6互作促进自噬进而调控PCD。拟南芥GAAPs（Golgi anti-apoptotic protein）是BI-1亚家族,实验室前期研究发现,GAAPs负调控UPR并抵抗ER胁迫诱导的细胞死亡,通过酵母双杂筛选出GAAPs的互作因子PAS2是合成极长链脂肪酸（Very long chain fatty acid,VLCFA）的关键酶,也具有抗磷酸酶功能,在真核生物发育和信号转导中都至关重要。为进一步确定PAS2及PAS2与GAAPs互作在胁迫中的功能,本文分析了拟南芥PAS2及PAS2与GAAPs互作在ER胁迫和生物胁迫中的功能,并初步探究了其调控机制。主要研究结果如下:1、PAS2及其与GAAPs互作正调控ER胁迫抗性并抗ER胁迫诱导的细胞死亡。DTT或TM诱导的ER胁迫条件下,PAS2突变体和PAS2与GAAPs双突变体在整体水平对于ER胁迫高度敏感。DTT处理土壤生长材料,处于营养生长期的pas2-5、pas2-5gaap1-1和pas2-5gaap2-2的长势明显差于Col,光合作用也受到一定影响;无菌培养的幼苗经TM处理后,pas2-5、pas2-5gaap1-1和pas2-5gaap2-2的地上部分和地下部分明显受到抑制,健壮率及根长显著低于Col,相对电导率显著高于Col,说明幼苗期的PAS2突变体和PAS2与GAAPs双突变体植株对于ER胁迫更为敏感;离体黑暗条件下,pas2-5gaap1-1的叶片黄化现象严重;台盼蓝及PI染色结果表明,pas2-3和pas2-7以及pas2-5gaap1-1和pas2-5gaap2-2的细胞死亡程度及细胞膜透性显著高于Col,而PAS2过量表达株系则显著低于Col。这些结果说明PAS2及PAS2与GAAPs互作可以抵抗ER胁迫及ER胁迫诱导的细胞死亡。2、PAS2及其与GAAPs互作抑制ER胁迫诱导的ROS积累。DAB染色结果显示,TM处理36 h,与Col相比PAS2突变体中的ROS在根的过渡区及伸长区高度积累,子叶也有区域化ROS聚集,而PAS2过表达株系中的ROS只有少量积累;q-PCR在转录水平检测ROS爆发相关基因发现,TM处理24 h,RBOHD、RBOHF和ERO1在Col中表达上调,PAS2突变体中RBOHD和RBOHF表达基本没有变化,说明在ER胁迫持续阶段PAS2突变促进ROS积累,但在转录水平抑制质膜ROS产生。TM处理6 h,pas2-5gaap1-1和pas2-5gaap2-2中H2DCF-DA信号显著强于Col,说明PAS2与GAAPs双突变体要早于Col激活ER胁迫诱导的ROS产生;胁迫时间延长至36 h,pas2-5gaap1-1和pas2-5gaap2-2的DAB染色程度及范围显著增强,ROS过度堆积,促进根的细胞死亡。这些结果说明PAS2及其与GAAPs互作在ER胁迫下抑制ROS的过度积累。3、PAS2与GAAPs、IRE1互作正调控ER胁迫诱导的细胞自噬。q-PCR检测持续弱胁迫和急性胁迫下PAS2与GAAPs双突变体的UPR通路基因发现,PAS2与GAAPs互作在转录水平对于UPR通路影响不大。MDC染色结果显示,DTT处理后PAS2突变体及PAS2与GAAPs双突变体内自噬小体数目极少;ATG6、ATG8和ATG5在内的多个自噬相关基因在pas2-5gaap1-1中表达下调;Western Blot检测ATG8蛋白表达量在突变体中显著降低,PAS2回复株系恢复至Col水平,这说明PAS2突变及PAS2与GAAPs双突变抑制ER胁迫下的自噬发生。PAS2亚细胞定位表明PAS2定位于内质网、囊泡和液泡在内的多种内膜系统,结合Bi FC荧光结果PAS2与IRE1A和IRE1B在亚细胞水平互作,说明PAS2极有可能通过与IRE1互作参与自噬调控,PAS2与GAAPs、IRE1互作正调控ER胁迫诱导的细胞自噬。4、PAS2参与调控营养缺陷诱导的细胞自噬。通过低N和缺N培养基培养植株发现,PAS2单突变体的花青素高度积累,叶绿素含量显著降低,白化死亡现象严重,对于N元素不足的饥饿条件极其敏感,但PAS2过表达株系长势良好,这说明PAS2参与调控营养缺陷诱导的细胞自噬。5、PAS2及其与GAAPs互作抵抗灰霉菌侵袭。以荧光标记的灰霉菌孢子侵染拟南芥叶片,Confocal观察发现PAS2突变及PAS2与GAAPs双突变促进灰霉菌孢子萌发生成菌丝,PAS2回复株系抑制孢子萌发;接种灰霉菌6 h,q-PCR检测JA和SA通路marker基因表达情况,发现JA通路的PDF1.2A、PDF1.3、PR-4以及ORA59在双突变体中全部表达大幅度下调,且表达量显著低于Col,但在PAS2回复株系中显著上调;而SA通路基因ICS1和NPR1表达在各株系间差异不大,这些结果说明PAS2与GAAPs互作在转录水平可能主要是通过促进JA通路抗性基因上调来响应灰霉菌早期入侵信号。灰霉菌持续侵染阶段,PAS2突变及PAS2与GAAPs双突变接种叶片迅速黄化,叶绿素含量下降,其他未接种叶片的黄化也最严重,植物衰败明显,而PAS2过表达株系则可以抵抗灰霉菌诱导的胁迫信号传递及危害反应。这些结果说明PAS2及PAS2与GAAPs互作可以抵抗灰霉菌及其诱导的胁迫反应。综上所述,拟南芥中PAS2与GAAPs互作参与抗ER胁迫,二者主要通过影响ROS和参与IRE1介导的细胞自噬,增强ER胁迫抗性并抵制ER胁迫诱导的细胞死亡。此外,PAS2还参与营养缺陷诱导的细胞自噬调控;PAS2及其与GAAPs互作在灰霉菌侵染诱导的生物胁迫下的抗性调控中也发挥重要作用,可能通过促进JA通路启动响应灰霉菌诱导的早期生物胁迫,抑制灰霉菌孢子萌发并提高对灰霉菌长期侵染的抗性。这些结果为揭示PAS2在逆境调控中的功能奠定理论基础,有助于深入了解GAAPs抵抗非生物胁迫下的细胞死亡机制。进一步研究PAS2与GAAPs互作调控胁迫诱导的细胞自噬的具体机制,有助于提高人们对非生物胁迫条件下自噬的诱导发生与植物抗性机制的认识,从而增加改良农作物性状的策略。