磷脂酶D(PLD)是植物组织中普遍存在的一种酶。PLD及其产物PA在信号传导、膜脂降解中起重要作用,与植物胁迫密切相关。黄瓜作为主要的蔬菜,在种植过程中经常遇到盐害、干旱等逆境胁迫。本试验以‘新泰密刺’黄瓜为试材,用RT-PCR结合RACE法从黄瓜幼叶中克隆了PLD基因的全长序列,并构建其正反义表达载体,分别用农杆菌介导法和子房注射法进行了烟草和黄瓜的转基因研究,并利用RealTime-PCR法对NO3-胁迫下黄瓜PLD基因的表达进行了定量分析。主要结果如下:1利用RT-PCR结合RACE技术获得了黄瓜磷脂酶D基因,命名为cuPLDα,GenBank注册号为EF363796。2序列分析表明,cuPLDαcDNA全长2,756 bp,编码区2,427 bp,编码808个氨基酸,预测蛋白质分子量约为91.8 kD,等电点为5.37。黄瓜磷脂酶Dα存在C2结构域、IYIENQFF结构域和HKD结构域。黄瓜磷脂酶Dα属于磷脂酶Dα家族,不存在有意义跨膜螺旋结构。3提出一个新的解决基因克隆中基因突变的方法:通过拼接两个或以上阳性克隆的非突变区域,构建无突变全长cDNA。4利用RealTime-PCR法分析发现,经不同浓度NO3-处理0.5 h后,cuPLDα表达随NO3-浓度增加而增强。182 mmol/L的NO3-处理cuPLDα表达最强,为对照的4.66倍。5为研究黄瓜磷脂酶Dα的功能,构建其正义表达载体pBI121-cuPLD和反义表达载体pBI121-PLD1,并分别通过农杆菌侵染法和子房注射法转化了烟草和黄瓜。