背景及目的肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,己经成为全球癌症相关死亡的主要原因。肺癌可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)两类。手术、化疗、靶向治疗及放疗是肺癌的主要治疗手段。尽管目前肺癌的诊治水平不断进步,但肺癌患者长期生存并不乐观,总体5年生存率只有10%-20%。局部复发和远处转移是导致肺癌患者死亡的主要原因。肺癌的发生、发展是多基因改变共同作用的结果,涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前基因靶向治疗己经成为肺癌研究的新热点,发现和认识新的治疗靶点并用于肺癌的诊断和治疗,具有重要的临床价值及重大的现实意义。微小RNA(miRNA,microRNA)长度为19-25个核苷酸的小非编码RNA,广泛存在于动植物体内,影响许多蛋白编码基因的表达。miRNA通过与靶m RNA特异结合可以抑制靶m RNA翻译或降解靶m RNA。miRNA参与调控细胞分化、增殖、生长、迁移、凋亡等许多细胞行为。miRNA表达异常在肿瘤发生、进展和复发中发挥重要作用,扮演着抑癌或促进癌症的作用。miR-9、miR-92b、miR-224和miR-183等为癌基因并促进肺癌转移。miR-101、miR-133a和miR-141等为抑癌基因,可以显著抑制肺癌细胞转移。此外,与肺癌相关的存在于血液,血清,血浆和唾液中的miRNA同样在肺癌中发挥着重要的作用,使miRNA成为一种新的肿瘤标志物。整合素(integrin,ITGB)属于细胞表面分子,是一类由α和β亚基以非共价键形式结合组成的跨膜蛋白受体,介导细胞之间以及细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的粘附。整合素因其跨膜结构的特殊性而具有双向信号转导功能。目前已发现18种α亚基和8种β亚基,可形成24种异源二聚体,分布于全身不同组织和器官,发挥各自的生物学功能。同时,整合素也与疾病的发生和发展密切相关,其信号转导途径也能参与肿瘤的发生和发展。整合素的突变或异常表达通常被认为与肿瘤的发生和转移相关。整合素β3(integrin beta3,ITGB3)属于β亚基中的一员,在全身不同组织中均有表达,参与多种生物学过程,发挥不同的生理功能。ITGB3是多种蛋白质(诸如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、基质金属蛋白酶-2、骨调蛋白和玻连蛋白)的共同受体。已在各种恶性肿瘤中观察到ITGB3表达高度升高。ITGB3对于急性粒细胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)发生发挥关键作用,使其成为潜在治疗靶点。有研究证实ITGB3是诱发结直肠癌细胞迁移和侵袭的一种重要调节因子。在乳腺癌中,m RNA表达谱排列表明,转移性肿瘤细胞的一些血管生成相关蛋白(包括ITGB3)显著上调。此外,最新研究证明,肺癌组织中表达下调的let-7c,通过靶向作用于ITGB3抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。miR-338家族(miR-338,miR-338-3p,miR-338-5p)位于凋亡相关酪氨酸激酶7号内含子上。已经证实miR-338在肝细胞癌、口腔癌和食管鳞状细胞癌中表达下调。miR-338过度表达可以抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡。肝细胞癌中的miR-338水平恢复可使癌细胞对索拉非尼治疗敏感。研究已经证实,miR-338能够通过靶向作用于Smoothened抑制结直肠癌细胞侵袭和迁移。但仍然不清楚miR-338在肺癌转移中的作用机制。在本研究中,我们尝试使用实时荧光PCR(q RT-PCR)检测评估5个肺癌细胞株、1个人肺成纤维细胞MRC-5细胞株及115例肺癌组织、癌旁正常肺组织中miR-338的表达。构建miR-338过表达肺癌细胞株,探索在体外环境下miR-338对肺癌细胞增殖、粘附、迁移及侵袭的影响。并检测miR-338过表达肺癌细胞株中ITGB3蛋白质的表达,初步研究miR-338抑制肺癌转移的分子靶向作用机制。本课题包含以下三个部分:第一部分:miR-338在肺癌细胞株及肺癌组织中的表达及意义;第二部分:上调miR-338表达对肺癌细胞株A549、NCI-H292生物学行为的影响;第三部分:miR-338通过靶向作用于整合素β3抑制肺癌转移。第一部分miR-338在肺癌细胞株及肺癌组织中的表达及意义方法:1、培养5个肺癌细胞株(A549、NCI-H292、NCI-H460、NCI-H446、NCI-H1299)和1个人肺成纤维细胞MRC-5细胞株。2、收集手术切除的115例肺癌组织及相对应的癌旁正常肺组织标本。3、提取所有细胞株和115例肺癌组织及相对应的癌旁正常肺组织的RNA,并用q RT-PCR检测miR-338的表达。4、分析肺癌组织中的miR-338表达与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、肿瘤癌栓、淋巴结转移、肿瘤复发及TNM分期之间的相关性。5、使用SPSS 13.0对数据进行分析,并以平均值±标准差的形式表示。使用配对样本t检验估计两组间差异。使用单因素方差分析(ANOVA)分析miR-338表达与临床病理因素之间关系,并使用对数秩检验根据Kaplan-Meier法划出生存曲线。如果p<0.05,则认为组间差异具有统计学意义。结果:1、与人肺成纤维细胞MRC-5细胞相比,所有肺癌细胞株中的miR-338表达显著下调(A549 1.0vs0.15±0.01、NCI-H292 1.0vs0.35±0.12、NCI-H4601.0vs0.3±0.02、NCI-H446 1.0vs0.25±0.07、NCI-H1299 1.0vs0.275±0.01,p<0.05)。2、与癌旁正常肺组织相比,115例肺癌组织中的miR-338表达显著下调(0vs-2.99±3.69,p<0.001)。肺癌组织中的miR-338表达降低与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小和淋巴结转移无关(p>0.05)。miR-338表达降低与肿瘤癌栓、肿瘤复发、TNM分期相关(p值分别为0.005、0.004、0.025)。低miR-338表达组的5年总生存率显著低于高miR-338表达组(中位生存时间44个月vs53个月,P=0.001)。第二部分:上调miR-338表达对肺癌细胞株A549、NCI-H292生物学行为的影响方法:1、构建、培养重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞细胞株,用q RT-PCR检测细胞中miR-338的表达。2、CCK-8法检测重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞及对照细胞增殖和生长能力。3、检测重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞及对照细胞粘附能力。4、Transwell小室实验检测重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞及对照细胞的迁移及侵袭能力。5、裸鼠移植瘤模型实验检测重组miR-338慢病毒感染的NCI-H292细胞及对照细胞对裸鼠肺移植瘤的影响。6、使用SPSS 13.0对数据进行分析,并以平均值±标准差的形式表示。使用配对样本t检验估计两组间差异。如果p<0.05,则认为组间差异具有统计学意义。结果:1、重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞较对照细胞miR-338的表达明显升高(A549 646.37±35.45vs23.05±3.56、NCI-H292330.86±11.05vs10.54±2.35,P<0.05)。成功构建了高表达miR-338的肺癌细胞株。2、在体外环境下上调miR-338的表达可以抑制A549、NCI-H292肺癌细胞的增殖(P<0.05)、粘附(A549平均细胞计数1233±249vs310±22,p=0.035)(NCI-H292平均细胞计数180±16vs72±10,p=0.028)、迁移(A549平均细胞计数347±41vs190±8,p=0.029)(NCI-H292平均细胞计数287±33vs127±21,p=0.045)及侵袭能力(A549平均细胞计数197±12vs68±14,p=0.008)(NCI-H292平均细胞计数106±10vs41±3,p=0.006)。3、裸鼠异种移植肿瘤模型实验表明,miR-338高表达能有效地抑制裸鼠肺移植瘤的生长(平均肿瘤克隆数20±7vs4±2,p=0.004)。第三部分miR-338通过靶向作用于整合素β3抑制肺癌转移方法:1、生物信息学分析推测ITGB3为miR-338靶基因。2、用Western免疫印迹检测miR-338过度表达肺癌细胞株A549和NCI-H292及对照细胞中的ITGB3蛋白质表达。3、双荧光素酶报告检测验证miR-338靶基因。4、使用SPSS 13.0对数据进行分析,并以平均值±标准差的形式表示。使用配对样本t检验估计两组间差异。如果p<0.05,则认为组间差异具有统计学意义。结果:1、miR-338过表达肺癌细胞株A549和NCI-H292中的ITGB3蛋白质表达较对照细胞均明显降低(A549 1.0vs0.35±0.04,p<0.001)(NCI-H2921.0vs0.69±0.07,p=0.01)。2、双荧光素酶报告检测结果显示miR-338过表达组的荧光素酶活性较对照组降低(A549 1.0vs0.75±0.08,p=0.03)(NCI-H292 1.0vs0.62±0.06,p=0.008)。结论:1、在肺癌细胞株及肺癌组织中,miR-338表达水平较正常细胞及组织显著降低。在肺癌组织中miR-338表达水平与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小和淋巴结转移无关,而与肿瘤癌栓、肿瘤复发、TNM分期相关。低miR-338表达组的5年总生存率显著低于高miR-338表达组。2、体外上调肺癌细胞中miR-338表达水平可有效抑制肺癌细胞的增殖、粘附能力,降低肺癌细胞的迁移和侵袭能力。3、miR-338是通过作用于靶基因ITGB3 mRNA3’UTR区,从而对其表达产生负调控作用。miR-338发挥抑癌作用。ITGB3是一种新的miR-338肺癌靶基因,为肺癌基因治疗潜在的新靶点。