【摘 要】
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[背 景]早发性脊柱侧凸（EOS）严重影响儿童生长及身心发育,先天性半椎体畸形是一种常见致病因素且进展迅速。EOS治疗手段包括非手术治疗与手术治疗。对于进展快、畸形重的患儿,非手术治疗效果欠佳,且难以保证其依从性,而手术治疗方案选择及治疗时机难以把控,又面临着反复手术所带来的并发症高风险及对患儿身心健康产生的不良影响。壳聚糖/β-甘油磷酸酯水凝胶具有温度敏感性溶胶-凝胶转变特性以及药物缓释性能,而
【基金项目】
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《搭载TNF-a的壳聚糖缓释系统的阻滞效应治疗先天性半椎体的研究》,国家自然科学基金,编号:81960413；
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[背 景]早发性脊柱侧凸（EOS）严重影响儿童生长及身心发育,先天性半椎体畸形是一种常见致病因素且进展迅速。EOS治疗手段包括非手术治疗与手术治疗。对于进展快、畸形重的患儿,非手术治疗效果欠佳,且难以保证其依从性,而手术治疗方案选择及治疗时机难以把控,又面临着反复手术所带来的并发症高风险及对患儿身心健康产生的不良影响。壳聚糖/β-甘油磷酸酯水凝胶具有温度敏感性溶胶-凝胶转变特性以及药物缓释性能,而TNF-α在中高浓度下能促进椎体生长板软骨细胞凋亡,低浓度时会促进新骨形成与骨融合。构建一种原位植入性给药系统,有望通过局部注射药物的方式减缓甚至控制EOS患者畸形的进展,保障患儿胸廓与肺功能协调发育,减少由于多次手术带来的并发症风险及心理问题,降低经济负担。[目 的]制备搭载不同浓度TNF-α的温敏性壳聚糖/β-甘油磷酸酯水凝胶,体外培养幼猪椎体生长板软骨细胞,探究载药水凝胶对软骨细胞凋亡及细胞外基质的影响,探索适宜的载药浓度,以期为后续动物实验及临床应用提供理论参考。[方 法]1.制备壳聚糖/β-甘油磷酸酯水凝胶体系,用试管倒置法测定37℃成胶时间,观察绿色荧光蛋白（GFP）转染的软骨细胞在水凝胶上的生长情况,并绘制搭载TNF-α的壳聚糖水凝胶的药物释放曲线。2.制备搭载不同浓度（25、50、75、100ng/ml）TNF-α的温敏性壳聚糖/β-甘油磷酸酯水凝胶并小室中培养软骨细胞24h,PCR检测软骨细胞caspase-3、aggrecan及collagen Ⅱα mRNA的表达,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率,并筛选合适的药物浓度。[结 果]1.所制备的壳聚糖/β-甘油磷酸酯溶胶呈乳白色,半透明,在37℃条件下5分钟完成溶胶-凝胶转变,具有温度敏感性,显微镜下观察到GFP转染的软骨细胞生长良好,水凝胶体系细胞相容性良好。将TNF-α包埋到壳聚糖溶液后再加入β-甘油磷酸钠混合所制备的载药水凝胶缓释效果良好,24h后TNF-α释放率（%）为 63.068±2.790。2.PCR检测caspase-3 mRNA表达结果显示:与对照组对比,不同浓度处理的软骨细胞的caspase-3 mRNA水平明显上升,差异具有显著性（P<0.05）。壳聚糖水凝胶搭载中低浓度（25-75ng/ml）TNF-α时caspase-3 mRNA水平随TNF-α浓度增加而升高,当TNF-α浓度达100ng/ml时,caspase-3 mRNA水平较前稍下降。3.PCR检测aggrecan及collagen Ⅱα mRNA表达结果显示:与对照组对比,不同浓度处理软骨细胞的aggrecan和collagen Ⅱα mRNA水平下降,差异具有显著性（P<0.05）。壳聚糖水凝胶搭载TNF-α浓度为25ng/ml时表达水平稍高,中高浓度（50-100ng/ml）下aggrecan和collagen Ⅱα mRNA水平下降程度随着TNF-α浓度升高而减少。4.流式细胞仪检测结果显示软骨细胞凋亡率随着壳聚糖水凝胶搭载TNF-α的浓度升高而升高（P<0.05）。[结 论]1.温敏性壳聚糖/β-甘油磷酸酯水凝胶具有良好的细胞相容性,37℃下能在5分钟内完成溶胶-凝胶转变,其药物释放曲线相对平缓,缓释效果良好,是一种良好的药物载体。2.搭载浓度为75ng/ml TNF-α的壳聚糖水凝胶能有效诱导生长板软骨细胞凋亡并减少基质的表达,影响其内环境稳态,干扰生长板软骨生长,可作为一种新的生长阻滞手段加以深入研究。
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