论文部分内容阅读
众多疾病的发生、发展与机体氧化应激密切相关,如衰老、糖尿病、心血管疾病等。为寻找高效、低毒的抗氧化药物,建立快速有效的筛选方法和筛选模型具有重要意义。本文旨在建立一种高效、简便、高度敏感的高通量筛选抗氧化药物的细胞模型,并应用于抗氧化候选药物的初步筛选。Keapl-Nrf2-ARE信号通路调节机体内多种抗氧化酶和ΙI相解毒酶的表达,在氧化应激反应中起着重要作用。本研究利用抗氧化反应元件ARE调控荧光素酶报告基因的表达水平,建立抗氧化药物筛选细胞模型。构建由ARE调控荧光素酶报告基因表达的重组质粒载体pARE-Luc-Neo。采用MTT法评价G418对Hek293的毒性作用,确定G418最佳筛选浓度为800μg/mL。使用FuGENE HD转染试剂将pARE-Luc-Neo转染Hek293细胞(人胚肾上皮细胞)。转染24h后,通过G418筛选,稀释法挑选阳性单克隆细胞株,获得26株单克隆细胞株。单克隆细胞株经ΙI相解毒酶诱导剂TBHQ诱导筛选,检测细胞中荧光素酶的活性,获得荧光素酶高表达细胞株Hek293-ARE。利用TBHQ、白藜芦醇、姜黄素和穿心莲内酯评价Hek293-ARE的筛选效果,结果表明TBHQ、白藜芦醇、姜黄素和穿心莲内酯对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达具有良好的诱导效果,且在一定范围内与诱导剂浓度呈剂量效应关系。从遗传稳定性和表达稳定性两方面验证细胞模型的稳定性,结果表明细胞模型稳定性良好,经过以上验证表明成功建立了抗氧化药物细胞筛选模型,Hek293-ARE细胞可用于抗氧化药物的初步筛选。将细胞模型应用于对现有的18种中药单体的筛选,结果表明中药单体熊果酸、隐丹参酮、黄连素、水飞蓟素、芹菜素、染料木素、灯盏花素、黄芩苷、大豆苷元、汉黄芩素、大黄素和大黄酸对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达有良好的诱导效果,并在一定范围内具有明显的剂量效应关系,提示这12种中药单体可能通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路发挥其抗炎、抗氧化等作用。对蛹虫草粗多糖的筛选结果表明,蛹虫草粗多糖对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达有良好的诱导效果,并在一定范围内具有明显的效应剂量关系,提示蛹虫草粗多糖能够诱导抗氧化酶和ΙΙ相解毒酶的表达而起到抗氧化的作用。对蛹虫草水提组分的筛选结果表明,2#、3#、4#、7#、11#、12#和14#样品对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达有良好的诱导效果,提示这些组分可激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,从而可能具有抗氧化的作用。抗氧化药物筛选细胞模型成功的建立为发现新型抗氧化药物,从天然药物中大规模快速筛选具有抗氧化作用的活性成分,提供了先进、有效、高通量的筛选途径,并对抗氧化药物作用机制的研究具有重要意义。