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钙整合素结合蛋白(Calcium and Interin Binding protein,CIB)是含有EF-hand结构域的钙离子结合蛋白,可与血小板integrinαllbβ3等许多效应蛋白结合,并依赖Ca2+的调控而调节它们的功能。它在各组织中广泛表达,作为一个重要的中间分子,在机体中执行多种功能。目前,国内外对钙整合素结合蛋白的研究多数集中在脊椎动物上,而对无脊椎动物的报道很少。
我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,通过同源序列比对后发现其为家蚕钙整合素结合蛋白(Bombyx mori Calcium and IntegrinBinding protein,BmCIB)基因。该基因全长为939 bp,ORF为558 bp,编码185个氨基酸残基。通过扩增BmCIB基因完整的ORF序列,克隆到表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上,构建了重组表达载体pET28a(+)-BmCIB。经PCR、酶切鉴定以及测序证明了该重组子的正确性后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。以终浓度为1 mM的IPTG诱导,并收集菌体裂解,经SDS-PAGE分析,在26 kD左右的位置出现了一条特异性蛋白条带,与预期值(融合标签3.56 kD,BmCIB21.16 kD)大体相符。重组蛋白以包涵体形式存在,超声裂解菌体后12000 rpm离心,收集沉淀经包涵体洗涤,溶解在含8 M尿素的溶解液中,再以亲和层析的方法进一步纯化。经透析除盐后,进行了质谱分析,测定该重组蛋白的精确分子量为24877.0508 Da,与其理论值24720.99 Da非常接近,可以确定该蛋白为重组的BmCIB。以纯化所得重组蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价在抗原浓度为10μg/mL时达到1:12800以上。用Protein A凝胶柱纯化了多克隆抗体。利用荧光定量PCR的方法,对家蚕四个发育时期以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较,结果显示其mRNA转录水平分别以蛹期和生殖腺中最高,同时我们提取家蚕各发育时期及五龄幼虫的各组织蛋白,用于Western blotting实验。实验结果表明,BmCIB蛋白的表达量在家蚕各发育时期中差异不大;在五龄幼虫各组织中以生殖腺中最多。通过免疫荧光法分析BmCIB蛋白在家蚕BmN细胞的亚细胞定位,发现其定位于细胞质中。以上工作为进一步研究BmCIB的功能奠定了基础。