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第一部分 LncRNA-DPT的表达及其与妊娠期肝内胆汁淤积症的发病相关研究目的:探讨 LncRNA-Dermatopontin(LncRNA-DPT)及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)在妊娠期肝内胆汁淤积症患者母胎界面的表达。分析LncRNA-DPT通过诱导细胞凋亡、并下调iNOS的表达,参与妊娠期肝内胆汁淤积症的发病机制。方法:1.随机纳入两组研究对象,正常妊娠孕妇80例,妊娠期肝内胆汁淤积症患者77例,分析两组研究对象的一般临床资料及生化指标;2.采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测两组研究对象母胎界面LncRNA-DPT的表达水平;3.采用RT-qPCR检测iNOS在两组胎盘和脐带组织细胞的表达水平;4.采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IH)检测两组胎盘组织中iNOS的表达情况;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测iNOS在两组母体和脐带血浆的表达水平;5.采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)方法检测iNOS蛋白在两组胎盘和脐带组织细胞的表达水平;6.采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,Tunnel)染色技术和测定线粒体活性氧的方法检测胎盘和脐带组织细胞的凋亡情况。结果:1.两组研究对象的孕龄、BMI、孕次和产次均无统计学差异(p>0.05);ICP组的分娩孕周、血浆iNOS浓度、新生儿出生体重、胎盘重量和新生儿APGAR评分均小于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);ICP组的生化指标(TBA、CG、ALT、AST、TB、CB、UCB、TC、TG)、剖宫产率、胎儿宫内窘迫率、早产率、胎儿宫内生长受限率、新生儿入住NICU率均大于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);2.LncRNA-DPT在ICP患者胎盘组织中表达水平明显低于对照组胎盘组织的表达,差异具有统计学意义(p<0.05);3.母体血浆中iNOS与TBA的表达呈负相关(r=-0.450,p<0.05);iNOS与CG的表达呈负相关(r=-0.367,p<0.05);iNOS与ALT的表达呈负相关(r=-0.359,p<0.05);iNOS 与 AST 的表达呈负相关(r=-0.329,p<0.05);4.iNOS主要在胎盘合体滋养细胞中表达,其在ICP患者胎盘的表达明显减少,差异具有统计学意义(p<0.05);iNOS主要在脐带内皮细胞中表达,其在ICP患者脐带组织的表达明显减少,差异具有统计学意义(p<0.05);5.iNOS在ICP组母体血浆中的表达明显低于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);iNOS在ICP组脐带血浆中的表达明显低于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);6.ICP组胎盘组织线粒体活性氧的表达明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);7.通过荧光显微镜对荧光素标记的凋亡细胞进行观察,ICP组胎盘细胞凋亡率明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);ICP组脐带细胞凋亡率明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);结论:1.LncRNA-DPT和iNOS在ICP患者体内的异常表达可能与ICP的发病及疾病进展有关;2.LncRNA-DPT和iNOS在ICP患者体内的异常表达表明,LncRNA-DPT可能降低iNOS的表达,减少一氧化氮(Nitric oxide,NO)的合成,并同时激活组织细胞凋亡,参与ICP的发病及疾病进展。第二部分LncRNA-DPT上调NF-κB参与妊娠期肝内胆汁淤积症的分子机制目的:构建ICP大鼠模型,检测LncRNA-DPT及NF-κB信号通路相关蛋白在ICP大鼠体内的表达。探讨调节LncRNA-DPT的表达对NF-κB信号通路、下游iNOS表达及组织细胞凋亡的影响。方法:1.采用苯甲酸雌二醇构建ICP孕鼠模型,分析两组孕鼠的一般资料;2.采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测两组研究对象母胎界面LncRNA-DPT的表达水平;3.采用RT-qPCR检测iNOS在两组大鼠胎盘和脐带组织的表达;4.光学显微镜下观察ICP大鼠肝脏HE病理切片,证实ICP大鼠模型构建成功;采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IH)检测两组胎盘和脐带组织中iNOS的表达情况;采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)方法检测iNOS蛋白在两组胎盘组织细胞的表达水平;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测iNOS在两组大鼠血浆的表达水平;5.通过测定线粒体活性氧检测两组大鼠胎盘和脐带组织细胞的凋亡情况;6.调节人滋养细胞株HTR-8/SVneo的LncRNA-DPT表达,绘制细胞生长曲线观察细胞增殖能力变化,并分析其对NF-κB信号通路p65蛋白、下游iNOS的表达及细胞凋亡的影响。结果:1.纳入研究的两组大鼠均为第一次妊娠,在ICP模型构建前,两组大鼠的周龄、体重、TBA、CG、ALT和AST均无统计学差异(p>0.05);ICP模型成功构建后,ICP组大鼠的TBA、CG、ALT和AST均明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);2.RT-qPCR显示LncRNA-DPT在ICP大鼠胎盘组织中的表达水平明显低于正常大鼠胎盘组织,差异具有统计学意义(p<0.05);3.ICP大鼠肝脏HE病理切片可见肝脏细胞内胆汁淤积;iNOS主要在胎盘合体滋养细胞中表达,其在ICP大鼠胎盘的表达明显低于正常大鼠,差异具有统计学意义(p<0.05);iNOS主要在脐带内皮细胞中表达,其在ICP大鼠脐带组织的表达明显低于正常大鼠,差异具有统计学意义(p<0.05);4.iNOS在ICP组大鼠血浆的表达明显低于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);5.ICP组胎盘组织线粒体活性氧的表达明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);6.转染后,LncRNA-DPT在si-DPT组的表达明显低于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);7.根据MTT法绘制的细胞生长曲线显示,si-DPT组的细胞增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(p<0.05);8.流式细胞仪检测HTR-8/Svneo细胞的凋亡,si-DPT组的细胞凋亡率明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);9.p65蛋白在对照组细胞质的表达明显高于细胞核,差异具有统计学意义(p<0.05);p65蛋白在si-DPT组细胞质的表达明显低于细胞核,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.苯甲酸雌二醇能够成功构建ICP孕鼠模型,可用作ICP的研究;2.下调LncRNA-DPT可激活NF-κB信号通路,降低iNOS的表达,减少一氧化氮(Nitric oxide,NO)的合成,并促使组织细胞凋亡,参与ICP的发病及疾病进展。