哺乳动物基因组中存在大量不编码蛋白质的RNA序列,称为非编码RNAs （non-coding RNAs,ncRNAs）,起初被认为是基因组学的“暗物质”,但近年来研究提示,ncRNAs可从多个生物学层面实现对基因表达的调控,并参与多种疾病的病理生理学过程。microRNAs和长链非编码RNAs （long non-coding RNA, lncRNA）是隶属于ncRNAs的主要组成部分并成为研究热点,可从炎症、自噬、细胞增殖与凋亡等多方面调控动脉粥样硬化的病理进程；且二者均可表达于外周血并具有组织特异性,或可成为可靠的生物学标志物,用于疾病诊治并预后判断,同时为疾病的治疗提供新的药物作用靶点。此外,ncRNAs或可从RNA水平揭示中医证型的物质基础,为中医证型的客观化提供证据支持。课题组既往提出“瘀毒致变”引发急性心血管事件,认为瘀毒是急性心血管事件的病理基础,而冠心病瘀毒证患者的早期识别,或可进一步降低全人口心血管病死率。因此,差异ncRNAs表达谱的构建或可在冠心病瘀毒证研究中发挥重要作用。本研究拟通过基因芯片技术,构建冠心病瘀毒证差异ncRNAs表达谱,并进一步对部分差异表达的功能性ncRNAs进行qRT-PCR验证,同时借助LPS诱导的RAW264.7炎症性巨噬细胞构建体外实验体系,研究赤芍枳壳活性成分（芍药苷、柚皮苷）配伍对冠心病瘀毒证差异ncRNAs分子之一miR-155的干预效应。本研究将为冠心病瘀毒证生物学标记物和具有活血解毒功效的中药药理学作用研究提供一定实验依据。本课题研究分为三部分：文献综述、临床研究和实验研究。1.文献综述：本部分分别从非编码RNA与冠状动脉粥样硬化性心脏病研究进展、冠心病瘀毒理论与具有活血解毒功效中药的药理学研究进展两个方面进行综述。2.临床研究：包括以下三个部分。研究一冠心病瘀毒证差异microRNAs表达谱的构建目的：通过基因芯片技术,筛选冠心病瘀毒证差异microRNAs表达谱,并通过Go、Pathway分析进行差异microRNAs的功能学预测,发现与冠心病瘀毒证相关的microRNAs分子及其潜在的生物学功能。方法：冠心病诊断参照2007年中华医学会心血管病学分会、中华心血管病杂志编辑委员会公布的《慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》、《不稳定性心绞痛和急性非ST段抬高心肌梗死诊断指南》,2013年ESC稳定性冠状动脉疾病管理指南,2010年中华医学会心血管病学分会、中华心血管病杂志编辑委员会公布的《急性ST段抬高心肌梗死诊断指南》和2013ACCF/AHA ST段抬高心肌梗死指南。同时,参考中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的血瘀证诊断标准和冠心病因毒致病的辨证诊断及量化标准,并进行小范围专家共识以规定冠心病瘀毒证总计分≤11分为轻症,>11分为重症。筛选符合冠心病血瘀证、冠心病瘀毒轻证、冠心病瘀毒重证的患者各5例,对照组4例为无冠脉缺血证据的受试者。冠心病血瘀证组、瘀毒证组患者均于冠脉造影前采血,对照组于清晨空腹状态下抽取静脉血2ml,加入红细胞裂解液离心获取白细胞。应用基因芯片检测各组人群micro RNAs的表达。结果：冠心病血瘀证组、瘀毒轻证组、瘀毒重证组和对照组在年龄、性别间无显著差异；冠心病各证型组在合并疾病及用药情况方面无显著性差异,具有可比性。Go分析结果提示与对照组相比,冠心病血瘀证、瘀毒证差异microRNAs均主要参与到DNA转录调控并在蛋白结合过程中发挥生物学功能。Pathway分析提示与对照组相比,冠心病血瘀证差异microRNAs主要参与到代谢途径、泛素介导的蛋白质降解、内质网蛋白加工等过程；瘀毒证差异microRNAs主要参与到细胞增殖与凋亡、MAPK信号通路、actin细胞骨架、Wnt信号通路等生物学过程,从而影响机体免疫炎症反应,与既往冠心病急性心血管事件“瘀毒”理论的高度炎症状态、氧自由基损伤、血管活性物质等相契合。聚类分析结果提示与对照组相比,has-miR-1228-3p、has-miR-3157-3p在冠心病不同证型中均具有显著差异（FC>1.5且P<0.05）;与对照组相比,has-miR-3162-3p、has-miR-182-5p、 has-miR-363-3p、has-miR-455-3p、has-miR-1228-5p、has-miR-4443、 has-miR-3064-3p在冠心病血瘀证组无显著差异（不同时满足FC≥1.5,P<0.05）,但在冠心病瘀毒证组有显著差异（FC≥1.5,P<0.05）：与对照组相比,has-miR-155-5p等仅在冠心病瘀毒轻证组显示差异表达（FC≥1.5,P<0.05）；与对照组相比,has-miR-94、has-miR-128、has-let-7d-3p等在冠心病瘀毒重证组显示显著差异（FC≥1.5,P<0.05）。进一步通过靶基因预测部分microRNAs功能,提示差异表达的microRNAs均可参与到动脉粥样硬化的病理进展过程,如炎症、免疫应答、血小板活化、细胞增殖凋亡等。而上述差异microRNAs在冠心病血瘀证、瘀毒证中的表达呈递增或递减趋势,进一步突出了毒邪在冠心病证型演化过程中的潜在病理机制。结论：冠心病不同证型状态下,外周血白细胞中microRNAs的表达分布存在差异,其可能参与了冠心病瘀毒证的发生发展过程。其中,has-miR-182-5p、 has-miR-363-3p、has-miR-455-3p、has-miR-1228-5p、has-miR-941、has-miR-155-5p等microRNAs分子参与到机体免疫炎症反应、血小板活化等病理生理过程,与课题组前期提出的“瘀毒”理论相契合,从差异microRNAs分子所发挥的生物学功能方面初步验证了瘀毒理论与急性心血管事件的相关性。提示差异表达的microRNAs或可为后期冠心病瘀毒证特异性生物学标志物的研究奠定一定基础。研究二冠心病瘀毒证差异lncRNAs表达谱的构建目的：通过基因芯片技术,筛选冠心病瘀毒证差异lncRNAs,并对差异表达的lncRNAs进行lncRNA与mRNA的共表达分析和功能学预测,发现与冠心病瘀毒证相关的lncRNAs分子及其潜在的生物学功能。方法：纳入符合冠心病血瘀证、瘀毒轻证、瘀毒重证标准的患者各5例,无心肌缺血证据的对照组4例为研究对象。冠心病各证型组均于冠脉造影前采血,对照组于清晨空腹状态下抽取静脉血2m1,加入红细胞裂解液离心以获取白细胞。并应用基因芯片技术检测各组人群差异lncRNAs的表达。结果：冠心病血瘀证组、瘀毒轻证组、瘀毒重证组和对照组在年龄、性别间无显著差异；冠心病各证型组在合并疾病及用药情况等方面无显著差异,具有可比性。Pathway分析显示与对照组比较,冠心病血瘀证差异lncRNAs可能参与到自然杀伤细胞介导的细胞毒性、抗原递呈等生物学过程；瘀毒证差异lncRNAs可能与细胞粘附分子、细胞外基质、钙离子信号通路等密切相关；与冠心病血瘀证比较,冠心病瘀毒证差异lncRNAs可参与到MAPK信号通路、神经活性受体-配体相互作用、钙离子信号通路等过程,从而参与到机体免疫过程并影响斑块的不稳定,客观显示了冠心病血瘀证到瘀毒证的动态演变过程中炎症、免疫等所发挥的潜在作用。与对照组比较,冠心病血瘀证组、瘀毒证组显示差异表达的lncRNAs为NONHSAT118577、FR066195、TCONS 00017783、NONHSAT040728、ENST00000583306等211条（FC>2,P<0.05）；仅冠心病瘀毒证组与对照组比较显示差异表达的lncRNAs为NONHSAT040728、NONHSAT005533. NONHSAG029753、NONHSAG011835、NONHSAT125298等826条（血瘀证组与对照组比较不同时满足FC≥2,P<0.05：瘀毒证组与对照组比较满足FC≥2,P<0.05）；仅冠心病瘀毒重证组与对照组比较显示差异表达的lncRNAs为NONHSAT054767、NONHSAT081325、TCONS I2 00007025、NONHSAT096941、FR156571等1796条（血瘀证组较对照组、瘀毒轻证组与对照组比较不同时满足FC≥2,P<0.05；瘀毒重证组与对照组比较满足FC≥2,P<0.05）。提示冠心病瘀毒证组患者外周血白细胞中lncRNAs存在差异表达,这些lncRNAs共同构建了冠心病瘀毒证的差异表达谱。nRNAs共表达分析及功能预测提示差异表达的lncRNAs分子如NONHSAT118577、TCONS₀0017783、NONHSAT054767. ENST00000583306、NONHSAT130416等可参与到细胞自噬、凋亡、氧化应激、炎症、糖脂代谢等多个生物学过程。结论：在冠心病不同证型状态下,外周血白细胞中lncRNAs的表达分布存在差异,而功能学预测显示差异lncRNAs与炎症、免疫、细胞粘附等生物学过程相关,提示差异lncRNAs参与了冠心病瘀毒证的发生发展过程。冠心病瘀毒证差异lncRNAs分子如NONHSAT118577、TCONS₀0017783、NONHSAT054767、 ENST00000583306、NONHSAT130416等可参与到细胞自噬、凋亡、氧化应激、炎症、糖脂代谢等多个生物学过程,从差异lncRNAs的生物学功能方面亦验证了“瘀毒”理论与急性心血管事件的相关性；而上述差异lncRNAs在冠心病血瘀证、瘀毒证组中呈现趋势性表达,更突出了“毒”邪在细胞自噬、凋亡、氧化应激等冠心病病理生理学过程中所可能发挥的作用。而差异lncRNAs或亦可为后期冠心病瘀毒证特异性生物学标志物的研究奠定一定基础。研究三冠心病瘀毒证差异lncRNAs的临床验证目的：对基因芯片筛查中所获得的部分冠心病瘀毒证差异表达ncRNAs分子采用qRT-PCR进行临床验证,以发现或可作为冠心病瘀毒证生物学标志物后续研究的目标分子及药物作用新靶点的ncRNAs;方法：纳入符合入选标准的对照组、冠心病血瘀证组、瘀毒轻证组、瘀毒重证组各10例为研究对象。冠心病各证型组患者均于冠脉造影前采血,对照组于清晨空腹状态下抽取静脉血2ml,加入红细胞裂解液离心分别获取白细胞,并分别提取microRNAs、lncRNAs后,应用qRT-PCR对差异ncRNAs的表达进行验证。结果：冠心病血瘀证组、瘀毒证组和对照组在年龄、性别且冠心病各疾病组在合并病、用药情况等方面无显著性差异,具有可比性。与对照组比较,miR-155-5p在冠心病瘀毒轻证组有差异表达（P<0.05）；miR-182-5p在冠心病瘀毒轻证组、瘀毒重证组与对照组比较有差异表达（P<0.05）；miR-363-3p、miR-455-3p在血瘀证组、瘀毒轻证组、瘀毒重证组与对照组比较均有显著差异（P<0.05）；miR-941及miR-1228-5p仅在瘀毒重证组与对照组比较有显著差异（P<0.05）；而IncRNAs中NONHSAT118577在各组比较之间未显示出差异（P>0.05）；NONHSAT130416在冠心病瘀毒轻证、瘀毒重证组与对照组比较均显示有差异表达（P<0.05）。结论：miR-182-5p、miR-155-5p、miR-363-3p、miR-455-3p、miR-941、miR-1228-5p. NONHSAT130416在冠心病瘀毒证状态下与对照组比较其含量分布存在差异性,部分结果与前期芯片筛查结论一致,因此,这些ncRNAs或可为后续冠心病瘀毒证生物学标志物的研究提供方向。3.实验研究：赤芍枳壳活性成分对LPS刺激的炎症性巨噬细胞miR-155表达水平及相关炎症因子的体外干预效应研究目的：研究赤芍、枳壳活性成分对炎症因子及miR-155表达水平的体外干预效应。方法：以LPS诱导的炎症性RAW264.7巨噬细胞构建体外实验模型。采用EL1SA检测药物干预前后IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平；qRT-PCR检测miR-155的表达；构建双荧光素酶报告基因分析验证SHIP1及SOCS1是否为miR-155的靶基因,并行药物干预后采用Western Blot检测SOCS1、SHIP1的蛋白表达量。结果：与LPS刺激的炎症性巨噬细胞模型组比较,芍药苷96Rg/ml、柚皮苷75μg/ml可显著降低炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β及炎症相关基因miR-155的表达水平（P<0.05）,且二者配伍可协同降低IL-6、TNF-α、miR-155的表达（P<0.05）。双荧光素酶报告基因分析显示miR-155可作用于SHIP1和SOCS1的3’UTR区域,证实SOCS1和SHIP1为miR-155的靶基因。药物干预后显示：与模型组比较,芍药苷、芍药苷与柚皮苷配伍可显著升高SHIP1的蛋白表达量（P<0.05）：柚皮苷、芍药苷与柚皮苷配伍后可显著升高下调的SOCS1的蛋白表达量（P<0.05）。进一步转染niR-155 inhibitor后实施药物干预,与未转染miR-155 inhibitor组相比仅芍药苷与柚皮苷配伍可协同升高SHIP1蛋白表达（P<0.05）,余组均未提示可协同升高SHIP1和SOCS1蛋白表达的作用（P>0.05）。结论：赤芍枳壳活性成分芍药苷、柚皮苷可降低炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β及炎症相关基因miR-155的表达水平,二者配伍可发挥协同降低炎症因子IL-6、TNF-α和miR-155的作用,并同时升高相关靶基因SHIP1和SOCS1的蛋白表达含量；二者配伍使用较单药应用或具更显著的抗炎作用。