灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)是危害农作物的一种重要迁飞性害虫,其寄主范围广泛,可通过取食植物汁液传播斐济病毒属(Fijivirus)、纤细病毒属(Tenuivirus)和细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)等多个属的病毒,对农业生产形成极大威胁,已多次造成严重经济损失。切断灰飞虱对病毒的传播是防治病毒病最行之有效的方法之一。目前,对于灰飞虱传播斐济病毒属、纤细病毒属病毒的机制研究已经取得一定进展,但灰飞虱与植物弹状病毒的互作机制却少有研究。本文以灰飞虱及其传播的大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus,BYSMV)为研究对象开展灰飞虱与弹状病毒的传毒机制研究,筛选与灰飞虱获毒或互作相关的介体蛋白并解析功能,为阻断植物弹状病毒乃至以灰飞虱为介体的多种病毒的传播提供新的位点靶标具有重要科学意义。本研究首先构建了含全长BYSMV核衣壳蛋白(N)基因的诱饵载体pDHB1-N,功能验证结果表明pDHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。其次对文库筛选条件进行优化,确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)的使用浓度为12 mM时可去除可能存在的轻微筛库背景。然后利用分离泛素酵母双杂交系统,以pDHB1-N为诱饵对灰飞虱cDNA文库进行筛选,对得到的57个阳性克隆的序列进行比对分析,发现其中的20个序列可匹配到褐飞虱等物种的同源蛋白。利用GO注释对得到的表皮蛋白、泛素和核糖体膜相关蛋白等20个候选蛋白进行了分析,发现它们具有转运活性、氧化还原酶活性及结构分子活性等功能,参与细胞过程、代谢过程及应激反应等多个生理过程,并存在于细胞膜、细胞内、细胞外区域等不同细胞组分中。信号通路分析发现它们主要参与了脂肪酸生物合成,脂质代谢,信号传导途径等多个通路过程。同时,经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测检测进一步确认了其中的17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本实验室已在灰飞虱与水稻条纹病毒的互作机制研究中发现灰飞虱的表皮蛋白CPR1可与水稻条纹病毒结合,帮助病毒逃避寄主血淋巴的免疫作用从而保护病毒不被降解。本文也通过筛库获得了同一表皮蛋白CPR1的全长基因,将其大量表达并进行纯化后,利用GST pull-down实验验证了CPR1可与BYSMV N蛋白发生体外互作。为明确CPR1在灰飞虱传播BYSMV中的功能,利用RNAi技术将合成的CPR1双链RNA(GFP为对照)显微注射至三龄带毒灰飞虱体内,明确沉默CPR1对灰飞虱传播BYSMV的影响。CPR1被沉默后,RT-qPCR分析发现BYSMV在灰飞虱体内的含量随着CPR1 mRNA转录水平的降低明显下降,注射后第六天下降幅度最高可达71.84%。同时,生物学接种实验也发现灰飞虱的传毒效率在沉默CPR1后下降了51.73%。以上实验结果表明,CPR1可在灰飞虱获毒或传毒过程中起到重要作用。此外,研究表明多种含有几丁质结合保守结构域的表皮蛋白参与了禾谷黄矮病毒(CYDV)、黄瓜花叶病毒(CMV)等病毒在介体内的传播,推测CPR1可能在帮助病毒在介体内逃避免疫完成传播的过程中存在广谱的作用,其关键作用位点可能为几丁质结合结构域。本研究为进一步探索弹状病毒与介体分子互作机制奠定了基础,为通过切断以昆虫为介体的病毒传播途径来防治病毒病的新策略提供了科学依据。