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颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs)是重要的卵泡细胞之一,其增殖、分化与卵泡的发育密切相关。颗粒细胞的增殖与代谢主要受促卵泡素(Follicle-Stimulating Hormone,FSH)调控,但FSH是否调控颗粒细胞糖酵解的作用与机制尚不明确。为此,本研究探讨了不同大小水牛卵泡颗粒细胞糖酵解与FSH的相关性,并通过体外培养进一步探究了FSH对颗粒细胞糖酵解代谢的调控与作用机制,以便为认识FSH调控水牛卵泡发育的作用机理奠定基础。1、探讨不同大小水牛卵泡颗粒细胞糖酵解与FSH的相关性。采用ELISA和q RT-PCR检测不同大小卵泡(小卵泡:2-5mm,中卵泡:5-8mm,大卵泡:大于8mm)中的FSH和乳酸浓度,及FSHR、糖酵解相关基因在颗粒细胞中的表达水平。结果显示,中卵泡液中的FSH和乳酸浓度显著高于小卵泡和大卵泡,中卵泡颗粒细胞的FSHR和糖酵解相关基因HK、PFK、MCT1、GLUT1、HIF-1α表达水平亦极显著高于小卵泡和大卵泡(P<0.01)。Western blot分析结果发现,糖酵解相关基因PKM2和LDHA也是在中卵泡的颗粒细胞中表达水平最高,与卵泡液中的FSH和乳酸浓度变化趋势一致。2、探讨了FSH对体外培养卵泡颗粒细胞糖酵解的影响。当卵泡颗粒细胞在不同浓度FSH(0 IU/m L、1 IU/m L、2 IU/m L、4 IU/m L、8 IU/m L)的培养液中培养12 h时,糖酵解相关基因GLUT1、HK、PFK、PKM2、LDHA、MCT1的m RNA表达水平随着浓度增加呈逐渐上升趋势,在FSH为4 IU/m L时最高(P<0.05)。Western blot检测结果显示,HIF-1α、GLUT1、PKM2和LDHA蛋白的表达水平亦随着FSH的浓度升高而上升,在FSH为4IU/m L时最高。当颗粒细胞在含4 IU/m LFSH的培养液中分别培养0 h、12h、24 h、48 h时,FSH培养处理12h的糖酵解相关基因的m RNA表达水平最高(P<0.05),然后随处理时间的延长而下降。以FSH浓度为4 IU/m L,检测经培养处理12 h的颗粒细胞的乳酸产生量和葡萄糖摄取量结果显示,处理组的乳酸水平显著上升,葡萄糖摄取量显著上调(P<0.05)。3、初步探明了FSH调控颗粒细胞糖酵解的作用机制。在不同大小卵泡颗粒细胞中的AMPK/SIRT1信号通路相关基因表达情况检测结果发现,AMPK的m RNA和蛋白表达水平、P-AMPK蛋白表达水平在中卵泡中最高,与不同大小卵泡中FSH、乳酸浓度和颗粒细胞中糖酵解关键蛋白PKM2、LDHA表达水平的变化趋势一致;而SIRT1蛋白与糖酵解相关蛋白(HIF-1α、GLUT1)的表达水平在不同大小卵泡颗粒细胞中的变化趋势一致。经不同浓度FSH培养处理12h的颗粒细胞AMPK/SIRT1信号通路相关基因表达的检测结果显示,AMPK和SIRT1在m RNA和蛋白表达水平随FSH处理浓度升高而上升。当用SRT1720(SIRT1激活剂)、FSH+sirtinol(SIRT1抑制剂)和AICAR(AMPK激活剂)培养处理颗粒细胞时,SIRT1激活组的糖酵解关键蛋白的表达水平和乳酸产生量升高,SIRT1抑制组则相反,AMPK激活组的乳酸水平变化不显著(P>0.05)。以上结果表明,体内水牛卵泡颗粒细胞和体外培养颗粒细胞的糖酵解与促卵泡素浓度呈正相关;AMPK/SIRT1通路的激活,尤其是SIRT1的激活在FSH对颗粒细胞糖酵解的调控中发挥重要作用。