SARS冠状病毒(SARS-CoV)，属于冠病毒科，冠状病毒属。根据其基因组结构分类，它属于单链正义RNA病毒。它是一种新发现的冠状病毒，是引起人类严重急性呼吸综合症(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS)，俗称“非典”的病原体。成熟的SARS-CoV颗粒直径约为60至220nm不等，其形态上与其它冠状病毒颗粒一样，病毒体成六角型状，最显著的特征在于病毒包膜外，有明显的棒状膜外子粒的结构。SARS-CoV基因组的测序与分析由加拿大不列颠哥伦比亚癌症机构基因科学中心率先完成，其组织结构与一般冠状病毒无异，5’端约三分之二的区域编码病毒RNA聚合酶复合蛋白，后三分之一的区域编码病毒结构蛋白。从5’至3’末端依次排列着复制酶、S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的编码基因，在S蛋白和E蛋白之间、M蛋白和N蛋白之间以及N蛋白末端有一些编码非结构蛋白的基因，其功能还不甚明了。 S蛋白(SpikeProtein)是一种跨膜糖蛋白，由SARS-CoV基因组21492-25259bp编码，长度约为1256个氨基酸，是结构蛋白区编码的最大的蛋白质，可分为三部分：C端膜内区，跨膜区，N端膜外区。研究已经证明S蛋白与病毒侵入细胞的过程密切相关，通过结合敏感细胞的表面受体，并诱导病毒包膜与细胞膜间的融合，使病毒能够将遗传物质RNA导入宿主细胞内，从而引起细胞感染。S蛋白根据其功能可分为两个大小相似的部份S1和S2。S1位于N端，构成S蛋白的球状头部区，通过非共价键与跨膜的杆状区S2片段相连。在病毒感染细胞的过程中，外周部分的S1通过其受体结合域(ReceptorBindingDomain，RBD)S318-510aa与靶细胞上的受体特异性结合，S1结构不同，其相应宿主细胞上的受体也不相同，因此它决定了冠状病毒对不同的宿主细胞嗜性。S2包含一个融合多肽，并有两个疏水区(HR1、HR2)，可形成同种或异种寡二聚体，携带位于HR1N端的融合多肽和跨膜锚定肽进入结合的宿主细胞，S2的构象发生变化，最终与细胞膜的融合。同时S蛋白是一个重要的抗原表位，能够诱导机体产生高亲和力的中和性抗体，可以作为疫苗研究的重要候选靶位，具有疾病的预防与治疗价值。 关于SARS-CoV的起源研究已经取得了一些研究进展，从人类SARS病人身上分离的huSARS-CoV和果子狸源性的pcSARS-CoV具有极其高的同源性，证实SARS-CoV源于动物，原本只是感染动物的冠状病毒由于发生基因突变、重组，产生变异株，导致抗原性和致病性的改变，从而成为感染人的病原体，由动物传给人并引起人类致病。已经在野生动物果子狸、鼠和猫等动物中分离到SARS-CoV，这些物种可能只是中间宿主，近来又在蝙蝠体内也发现了SARS-LCoV，这种病毒的最终来源于哪种动物到目前为止尚未清楚。血管紧张素转换酶2(angtiotension-covertingenzyme2，ACE2)是一种金属肽酶，过去已知其主要参与了包括血管紧张素在内的多种肽的代谢过程，在心血管疾病的病理生理方面发挥着重要作用。现研究证明ACE2也是SARS-CoV的重要功能性受体。RBD与ACE2的相互作用决定了SARS-CoV感染靶细胞的特异性，同时两者的结构和变异与病毒跨种属传播的机制密切相关。 本研究通过扩增SARS-CoVS蛋白的RBD基因，构建原核表达的重组质粒，在大肠杆菌表达系统中表达RBD。依据SARS-CoV基因组中RBD的基因序列，设计分别含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的上下游特异引物，以人和果子狸来源的SARS-CoV的S蛋白基因为模板扩增RBD基因。产物经回收纯化后与pGEM-TEasy载体进行T-A连接，转化DH5α大肠杆菌，提取质粒后用限制性内切酶消化，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并送测序，结果所扩增的RBD基因长度为579bp，序列在Genbank中经Blast程序比对，结果与Gen-bank报导SARS-CoVS蛋白的RBD序列相符。将S蛋白的RBD基因片段与质粒pGEX-6p-3进行连接，构建其原核表达的重组载体，用限制性内切酶消化确认阳性克隆，并在大肠杆菌BL21中表达。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹(WesternBlotting)检测表达情况，重组S蛋白的RBD基因能够在大肠杆菌获得良好的融合表达，表达的蛋白分子量约为47.6kD。同时我们根据其它物种已知的ACE2序列设计特异引物，应用cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends，RACE)技术从蹄鼻蝠的小肠组织提取的总RNA中，获得ACE2的5cDNA和3cDNA，根据ACE2的5cDNA和3cDNA的末端序列，设计上下游特异引物，用PCR方法扩增蹄鼻蝠ACE2的开放读码框(ORF)，PCR产物与pGEM-TEasy载体进行T-A克隆后送测序，得到ACE2的cDNA长度为2418bp，酶切位点分析后重新设计含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的上下游特异引物扩增蹄鼻蝠ACE2，并将其与质粒pcDNA3.1(+)进行连接，经酶切鉴定确认，成功构建了用于真核表达的重组质粒，为构建稳定表达的细胞系做好准备工作。 SARS是一种新的突发性传染病，可通过呼吸道等途径在人群间传播。严重危害人民群众的身体健康，给社会经济带来巨大影响。因此我们拟通过基因工程技术表达SARS-CoV的RBD蛋白，进一步免疫动物制备单克隆抗体，用于SARS的预防、诊断和治疗。同时克隆测序了蹄鼻蝠的SARS-CoV受体ACE2，并构建了真核的表达载体系统，为蝙蝠在SARS感染与传播机制中的地位研究奠定基础。