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作者所在实验室前期筛选到一株固氮菌草木樨箭菌Ensifer meliloti CGMCC 7333可降解烟碱类杀虫剂噻虫啉,其代谢途径为水解氰基亚胺基生成酰胺噻虫啉。本文进一步研究了该菌株代谢另一种烟碱类杀虫剂啶虫脒(acetamiprid,ACE)以及生物转化植物激素前体3-吲哚乙腈(indole-3-acetonitrile,IAN)。高效液相色谱(HPLC)分析显示E.meliloti CGMCC 7333可将ACE代谢为一个极性更强的化合物,出峰时间为3.80min,而底物和菌体对照在该保留时间内未出峰。质谱(LC/MS)和核磁共振光谱(NMR)分析表明,该产物为ACE的氰基水解产物IM-1-2。E.meliloti CGMCC 7333的静息细胞降解ACE的动力学曲线显示转化12h,初始浓度为2.12 mmol/L的ACE减少了 0.286mmol/L,ACE的降解率为13.5%,同时生成0.275 mmol/L的产物IM-1-2,摩尔转化效率为96%。其指数回归曲线方程为y=2.1233 e-00109t,相关系数(R2)为0.99,转化半衰期为63 h。腈水合酶表达菌株P3的静息细胞降解ACE的动力学曲线显示,转化100 min,初始浓度为2.04mmol/L的ACE减少了 1.97mmol/L,ACE的降解率为96.9%,同时生成1.84mmol/L的产物IM-1-2,摩尔转化效率为93.3%。其指数回归曲线方程为y=2.0206e-0.0352t,相关系数(R2)为0.99,降解半衰期为19.7 min。采用浸渍法和综合法,以蚕豆蚜2日龄若蚜为供试靶标,测定产物IM-1-2的生物活性,结果显示当IM-1-2浓度增加至lmg/L时,蚜虫死亡率仅为13.56%,表明IM-1-2几乎没有触杀和内吸活性。E.meliloti CGMCC 7333转化ACE生成IM-1-2,在12、24、36、48、72、96h的摩尔转化效率分别为96,94.6,90.5,73.7,57.2,43.8%,表明随着转化时间增加,ACE的摩尔转化效率逐渐降低。将加入E.meliloti CGMCC 7333的IM-1-2转化液(实验组)与不加菌体的IM-1-2转化液(对照组)在30℃,220r/min摇床中培养8 d,HPLC分析显示,IM-1-2分别减少了 1.40mmol/L,1.32mmol/L,降解率分别为67.5%,62.9%,其降解半衰期分别为4.9 d和5.5 d,相关系数(R2)均大于0.99,实验组与对照组中IM-1-2的降解情况无明显差异,表明ACE转化为IM-1-2的摩尔转化系数下降是由于IM-1-2自发降解导致的,而不是由于菌体的进一步降解作用。培养8d的对照组转化液产生了3个新的产物峰,保留时间分别为4.26、4.53和6.84 min,LC/MS分析显示三个产物为 IM-1-4,ACE-NH,ACE-NH2。E.meliloti CGMCC7333能转化植物激素前体3-吲哚乙腈生成一个极性更强的化合物。LC/MS和NMR分析表明,该产物为吲哚乙酰胺(indole-3-acetoamide,IAM)。CGMCC 7333不能将IAM进一步转化为吲哚乙酸(IAA),也不能直接将IAN直接转化为IAA。CGMCC 7333的静息细胞转化IAN的动力学曲线显示,转化48 h,初始浓度为6.41 mmol/L的IAN减少了 6.35mmol/L,IAN的转化率为99.1%,同时生成5.99 mmol/L的产物IAM,摩尔转化效率为94.4%。E.meliloti CGMCC7333的腈水合酶(NHase)基因簇由长度为642 bp、660 bp和387bp的α亚基基因、β亚基基因和激活蛋白基因组成。实验室前期已经构建了α、β亚基基因和激活蛋白基因共表达的菌株E.coli-pNABC。本文进一步构建了含NHase不同基因簇的重组质粒pNAB和pNA,将其分别转化进Escherichia coli Rosetta表达菌株中,得到了只表达NHaseα亚基的重组表达菌株E.coli-pNA,和使α、β亚基共表达的菌株E.coli-pNAB。E.coli-pNABC,E.coli-pNAB,E.coli-pNA 以及含空载质粒的E.coli-pN的静息细胞在相同条件下转化IAN,反应10 min,生成的产物IAM分别为4.14mmol/L,2.16mmol/L,0.13 mmol/L和0.08mmol/L。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示三个重组表达菌株的蛋白均得到表达,但是E.coli-pNAB,E.coli-pNA表达蛋白的可溶性比E.coli-pNABC低。上述结果表明,单独表达的腈水合酶α亚基没有活性;激活蛋白与NHase的共表达增强NHase的可溶性,从而提高NHase的活性。综上所述,本论文首次报道了固氮菌E.meliloti CGMCC 7333可转化ACE生成IM-1-2,IM-1-2 可自发降解为 ACE-NH2、ACE-NH 和IM-1-4。E.meliloti CGMCC 7333可以转化IAN生成IAM,但不能将IAM进一步转化为吲哚乙酸(IAA),激活蛋白与NHase的共表达能够增强NHase的活性和可溶性。