应用基因芯片技术研究四物汤补血作用机理 中医药学有着悠久的历史，中药是在中医理论的指导下，经过几千年中医临床实践证明可靠而行之有效的预防、治疗药物，是我国传统民族文化的瑰宝。然而中医药学真正得到继承和发展并为全世界承认接受，达到中药现代化，还必须做大量工作，作用机理研究是中药现代化的一个重要组成部分。中药多采用复方，化学成分复杂，其药理作用一般认为是多成分、多靶点、多途径协同作用、整体调节的结果。“中药基因组学”这一概念为中药机理研究以及中药现代化提供了新的思路。中药基因组学采用现代技术方法，结合传统中药理论和现代科学理论，将中药药性、功能及主治与其对特定疾病相关基因表达和调控的影响联系起来，在分子水平上用现代基因组学，特别是功能或疾病基因组学的理论来诠释传统中医药理论及作用机理。 本研究正是基于上述问题的解决和理论指导，制备并优化了造血相关小鼠细胞因子寡核苷酸表达谱芯片，并应用该芯片对传统补血良方“四物汤”的补血作用机理进行研究，旨在监测筛选四物汤作用前后造血相关细胞因子在基因表达水平上的变化，以快速、准确、高通量筛选其作用靶点，阐明其作用机理。本研究可为中药现代化提供新的思路和可行的技术平台。主要结果摘要如下： 1 造血相关寡核苷酸表达谱芯片的制备 首先对寡核苷酸芯片制备方法进行优化。选用两种基片，包括戊二醛法制备的醛基片和溴乙酰化法制备的溴化片。在两种基片上分别点制不同末端修饰和不同长度的探针，根据背景、荧光信号强度、检测灵敏度等指标进行优化。制备了一种新型的双功能探针，末端同时具有硫代基团和氨基基团。它和醛基片和溴化片都能结合，适用范围广。将其点制于溴化片上制备的芯片，结合效果好，杂交信号强，重复性好(CV在10％以内)。但双功能探针的制备成本较高。末端氨基修饰并接入PEG连接臂的探针点制于溴化片上制备的芯片(氨溴法)，效果稍逊于应用基因芯片技术研究中药四物汤补血作用机理中文摘要上述芯片，但成本较低。优化后的探针长40碱基，氨基修饰并连接有4个PEG。该方法制备的芯片杂交信号强度较大，检测灵敏度高，重复性好。因此选择氨澳法制备表达谱芯片。 从GeneBank中检索77条(含2条看家基因)造血相关小鼠细胞因子mRNA全序列，用Mprobe软件设计并在线Blast分析获得特异性寡核昔酸探针序列。按优化方法制备探针。用3 x Ssc点样液溶解探针至浓度为0.spg·ul一，，点于自制基片上，形成80点的微矩阵(4 x 20，含有75个造血相关小鼠细胞因子探针点和5个质控点)，同一杂交区内矩阵上下重复两次。芯片放置过夜后备用。2应用造血相关小鼠细胞因子表达谱芯片研究四物汤补血作用机理 细胞学实验选取小鼠骨髓基质细胞QXMSCI为模型，MTT法确定了四物汤总提物(S wT)、二幼越爪旋秘物B和80%乙醇提取物c最佳给药浓度为2mg’mr’(均为折算的生药量)。细胞长至80%贴壁后经15Gy 60CoY照射，之后换液培养并给药处理约6~sh。提取细胞总RNA，反转录并与已制备的芯片杂交，检测差异表达基因。结果显示四物汤总提物或不同提取物作用细胞后许一些胞因子分别表达上调:直接或间接促进不同阶段造血细胞增殖分化的因子GM一CSF、M一CSF、IL一3、PDGF一p、IL一9等，重要的免疫调节因子IL一3、IL一9、IL一17等，参与信号转导的因子IL一17、EPO一R、IL一4R等，这提示四物汤及其不同提取物通过影响细胞因子表达而发挥直接促进造血、通过提高免疫能力加强造血、影响信号转导途径促进造血等作用。对三种药物作用结果进行聚类分析，发现不同提取物B和C作用机理相近，它们与四物汤总提物有一定差异。 动物实验选用封闭群小鼠Balb/c，沿用本课题前期结果，采用5.SGy 60C。丫射线照射制备血虚证动物模型。照后分别给予smgkg一，·d-’、10mg’kg一‘·d’’的四物汤总提物(S WT)治疗。分别在给药第3日和第7日杀取骨髓、肾脏、脾脏、胸腺、肝脏，提取总RNA并进行反转录杂交，检测差异表达基因。结果表明四物汤对细胞因子表达有调控作用并籍此促进造血，发挥补血作用。其中，四物汤诱导骨髓大量分泌造血生长正向调控因子如IL一3、GM一CSF、CSFI、G一CSF、IL一6、EPO、IL一4、IL一5、IL一11等，直接促进骨髓造血:四物汤使不同脏器组织中免疫调节因子IL一2、IL一6、FGFR、CSFI、IGF一I等表达上调，MIP、IL一10表达下调，从而增应用基因芯片技术研究中药四物汤补血作用机理中文摘要强机体免疫而加强造血;四物汤使细胞信号转导通路因子如c-jun、c一fos、NF一KB、IL一4R、IL一17、EPO一R等表达上调以激活细胞因子造血调控网络，调动髓外造血器官分泌CSFs、EPO、IL一3等强造血因子促进造血;调动髓外造血组织发挥造血功能补充造血。 综合体内外实验，四物汤主要通过调节细胞因子，提升正向造血调控因子和免疫因子表达，抑制负向调控因子表达，促进造血调控相关的信号转导因子分泌，影响整个造血调控网络，通过多靶点、多途径综合发挥补血作用。同时?