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腈水合酶(EC4.2.1.84)是一种金属酶，在温和条件下，可将腈通过水合反应转化为相应的酰胺，现已广泛应用于酰胺类物质的工业化生产之中。本课题利用腈水合酶催化2-氨基-2,3-二甲基丁腈生成2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。通过对大肠杆菌重组腈水合酶酶库的筛选，获得一有催化活力的重组腈水合酶，对其进行了载体的重构建、酶学性质研究、发酵条件优化及反应体系的构建，最终构建了可生产2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的绿色制备工艺。具体内容分为以下几部分: 第一部分:菌株的筛选。以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，对本研究室大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行了筛选，通过初筛的铁离子显色反应及复筛的气相色谱检测，最终得到了一株来源于Pseudonocardia thermophila JCM3095的大肠杆菌重组菌，载体为pET-21a，据文献报道，该菌株为一株嗜热假诺卡氏菌，所产的腈水合酶为含钴型腈水合酶。 第二部分:载体的重构建及酶学性质研究。对筛选得到的菌株进行载体的重构建，载体为pET-28a，因含有组氨酸标签，可通过镍柱进行纯化，以获得纯酶进行酶学性质研究。结果发现，该酶的最适温度为35℃，最适pH为6.5，具有良好的热稳定性，高于文献中所报道的大部分腈水合酶的稳定性;在中性偏酸的条件下，稳定性较好，而碱性环境会对酶活造成严重的抑制。同时考察了金属离子和有机溶剂对酶活力的影响，发现分别添加一定量的Ni2+和异辛烷对酶活具有不同程度的促进作用。 第三部分:发酵条件优化。为了实现Co-NHase高水平表达，本课题在摇瓶水平下进行了菌株发酵条件优化。确定了以菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a+NHase为出发菌株，对其进行发酵优化。最佳培养条件:菌株在37℃下生长至OD600为0.8-1.0时，进行诱导，诱导剂为0.1 mM IPTG，诱导时同时加入0.3 mMCo2+，诱导温度为20℃;发酵培养基组分为1.6％(w/v)山梨醇、2％(w/v)胰蛋白胨、1％(w/v) Oxoid酵母提取物、0.25％(w/v) Na2HPO4;后期补料:当培养至4h、8h、12h、16h各补加1％(w/v)胰蛋白胨和0.2 mMCo2+。通过各方面的优化，对于菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a+NHase，OD600达到19.4时，酶活最高为3.723U/mL，比活达到1.044 U/mg。相较于LB培养基，OD600、酶活和比活分别提升5.86倍、26.6倍和4倍。 第四部分:反应体系的构建。遵循绿色化学的理念，旨在构建一种绿色反应体系。通过筛选12种不同种类、不同比例的绿色溶剂，最终确定了反应体系为HFE-7100/水(10％，v/v)两相体系，最佳反应条件:反应温度20℃，pH为7.0，投酶量为30 U/mL，底物浓度为120 mM。在该反应条件下，考察了全细胞在该体系中的批次使用能力，反应前七批的平均产率高达97.3％，明显高于现有的化学法和酶法。同时HFE-7100回收过程简单，且不会有任何性质的改变。本文首次将氟溶剂/水两相反应体系应用于生物催化反应之中。 结论:本课题通过筛选酶库、载体重构建、发酵条件的优化及构建反应体系获得了产物2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，产物的终收率为90.2％，纯度为98.5％，具有良好的应用前景。