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地中海贫血(Thalassmeia,简称地贫)是一种严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病,属于常染色体隐性遗传。主要病因是珠蛋白基因缺陷,导致珠蛋白肽链合成减少或缺失,临床表现为不同程度的进行性溶血性贫血。东南亚是地贫发病率较高的地区,与非洲和地中海地区最常见的镰状血红蛋白病(hemoglobin sickle,Hb S)不同,东南亚以产生血红蛋白 E(hemoglobin E,Hb E)的β-地贫为主,简称β,主要是由于β-珠蛋白基因26位密码子GAG突变成AAG,导致谷氨酸(Glu)变成了赖氨酸(Lys),这种改变激活了临近调节β-珠蛋白基因mRNA剪切的隐蔽剪切位点,激活的隐蔽剪切位点能与正常剪切位点竞争,使正常剪切的mRNA产量减少,而异常剪切的mRNA不稳定,致使β-珠蛋白基因合成量减少,同时还产生部分变异体mRNA,后者可指导结构异常但仍有功能的Hb E合成。通常βE患者的临床症状表现较轻,但当βE复合其他类型的β-地贫时,临床症状具有很大差异性,且研究表明单纯的β-珠蛋白基因的突变不足以解释这种差异,这提示了βE与地贫患者表型或影响表型的因素之间可能存在某种联系,因此,在排除β-珠蛋白基因突变的基础上,针对βE患者进行研究,有助于进一步了解βE/β-地贫的致病机理,从而为根据胎儿基因型给出较准确的遗传咨询提供理论依据。胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,Hb F)是影响β-地贫临床症状的重要因素之一,其表达的增加可以在一定程度上代偿性地缓解β-地贫症状,临床上已将提高Hb F作为治疗β-地贫的基本策略之一。根据临床观察,成人体内Hb F含量具有高度数量遗传特性,研究发现与Hb F表达相关的数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)主要包括位于染色体11β15的HBG2基因的上游、6q23上的HBS1L基因与MYB基因间区域和2β15上的BCL11A基因。到目前为止,尽管在β-地贫和Hb S病患者中对Hb F表达变化的分子机制已有报道,但在β患者中的研究尚未开展。基于以上理论基础,本论文以云南特有的β患者为研究对象,以Hb F为E切入点,分析其相关数量性状多态性,并完成了 β患者造血干细胞的体外培养和红细胞的初步定向诱导,为后续的机制和治疗研究提供载体,具体内容如下:(1)βE-地贫患者Hb F相关数量性状位点的多态性分析。研究收集中国云南特有的βE杂合子DNA样本100例,βE纯合子DNA样本11例,正常人(对照组)DNA样本100例,首先,对三组人群血液学指标进行分析,结果发现,对照组、βE杂合子组、βE纯合子组组间各血液学指标均存在显著性差异,其中,平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)及血红蛋白(Hemoglobin,Hb)呈下降趋势,这与之前的研究报道相一致,胎儿血红蛋白(Hb F)含量呈显著上升趋势;然后,对以上三组进行Hb F数量性状相关位点HBG2/Gγ-XmnI(11β15)、HBS1L-MYB(6q23)和 BCL11A(2β15)上的 9 个单核苷酸多态性分析(HBG2/Gγ-XmnIrs7482144,rs7937649;BCL11Ars4671393,rs1 1886868,rs766432;HBS1L-MYBrs9399137,rs35959442,rs9402685,rs9376090),卡方检验结果显示,Gγ-XmnI 上的 rs7428]44,HBS1L-MYB 上的rs35959442以及BCL11A上的rs766432和rs4671393四个位点的卡方检验结果P<0.05,均存在有显著性差异(P<0.05),基因型分析结果显示,四个突变纯合子 rs74821 44AA、rs35959442GG、rs4671393GG 及 rs766432 AA 在 βE 患者中均显著高于对照组。等位基因分析结果显示,四个位点的突变型等位基因rs7482144A、rs35959442G、rs4671393G 及 rs766432 A 在 βE杂合子组中的比例均高于正常人群组。从而确定了 βE、Hb F与β-地贫患者表型之间确实存在相关性。(2)βE-地贫患者造血干细胞的体外培养。收集βE-地贫患者的外周血,通过流式细胞仪分选造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)并使用无血清培养基加入细胞因子进行体外培养,观察细胞增殖的过程,在增殖生长6天后,加入人促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)进行诱导分化,在加入EPO的第三天,细胞形态开始发生变化,开始进入分化阶段。这些结果可以后期机制和治疗研究提供载体,最终为βE/β-地贫的产前诊断、早期干预及治疗提供新思路,新策略。