东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是寄生于水牛的一种重要的血液原虫,以镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)为传播媒介,临床症状为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等,严重时导致水牛死亡。东方巴贝斯虫病在我国南方许多省份发生和流行,造成严重经济危害。本实验室通过对东方巴贝斯虫的形态学、生活史、传播媒介和分子分类学等多方面详细研究,确立B. orientalis为一新种。近年来,本实验室致力于B.orientalis分子生物学研究,对东方巴贝斯虫进行了全基因组测序,为研究B.orientalis的功能基因提供了重要途径。小分子热休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)是分子量大小在12-43kDa,具有保守的约80～100氨基酸组成的α晶状体蛋白结构域的一类热休克蛋白亚家族。sHSPs与寄生虫感染具有重要的关系,其中小分子热休克蛋白HSP20影响顶复门寄生虫的移行和入侵等过程。巴贝斯虫的HSP20蛋白非常保守,是一种重要的虫体抗原,能够引起特异性T细胞的免疫应答。本研究通过比对基因组信息,找出东方巴贝斯虫HSP20基因片段,对该基因进行克隆和序列分析。随后对该基因进行表达,研究东方巴贝斯虫HSP20蛋白的免疫原性等,具体工作包括以下几个方面：(1)东方巴贝斯虫HSP20基因的克隆及序列分析通过比对东方巴贝斯虫基因组数据库找到与牛巴贝斯虫HSP20基因(AF331455.1)具有高同源性的序列片段。设计引物从东方巴贝斯虫基因组DNA中扩增得到690bp的完整东方巴贝斯虫HSP20基因(BoHsp20),其ORF为534bp,编码177个氨基酸。预测的蛋白序列中具有小分子热休克蛋白家族保守的α晶状体蛋白结构域,表明该蛋白为东方巴贝斯虫小分子热休克蛋白20(BoHSP20)。 BoHSP20序列与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫HSP20序列的同源性分别高达94%、86%和86%,以此蛋白序列建立的分子进化分析表明东方巴贝斯虫属于独立的巴贝斯虫新种,且与牛巴贝斯虫亲缘关系最接近。生物信息学分析表明,BoHSP20具有良好的抗原性。(2)东方巴贝斯虫HSP20的原核表达、纯化及重组蛋白的抗原性本研究克隆至BoHsp20完整的开放阅读框,将其插入原核表达载体pET-28a,成功构建了原核表达质粒pET-28a-BoHSP20。将重组质粒转入大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,经SDS-PAGE分析在约20kDa位置有明显的特异性表达条带,与预期一致,表明得到高效表达的重组蛋白His-BoHSP20。经镍亲和层析柱纯化后,得到单一的目的蛋白。用纯化后的BoHSP20蛋白与感染东方巴贝斯虫的水牛血清进行Western blot反应,BoHSP20蛋白与阳性牛血清可产生特异性的反应条带,表明该重组蛋白具有良好的抗原性。(3)东方巴贝斯虫HSP20的免疫反应原性用重组BoHSP20蛋白作为抗原,检测实验感染东方巴贝斯虫的水牛血清样品的抗体水平。结果表明,在水牛感染后的第16天即可检测到东方巴贝斯虫抗体,抗体水平维持较高值至感染的62天。说明东方巴贝斯虫HSP20可以诱导体液免疫。另外,用本研究制备的BoHSP20蛋白的多克隆抗体对东方巴贝斯虫进行间接免疫荧光试验。结果表明,多抗血清能识别东方巴贝斯虫虫体蛋白,特异性荧光分布于整个虫体表面。两方面实验表明,东方巴贝斯虫HSP20蛋白具有良好的免疫反应原性,可以诱导宿主的体液免疫反应,并且可用于东方巴贝斯虫的间接免疫荧光检测。(4)东方巴贝斯虫HSP20的分子伴侣活性检测本研究发现,将BoHSP20转入大肠杆菌中大量表达可以提高菌株在50℃热激条件下的存活率达2倍以上。另外,重组BoHSP20可抑制BSA在化学变性剂作用下的变性聚集。表明东方巴贝斯虫HSP20蛋白具有分子伴侣活性。本研究成功克隆了BoHsp20基因,该基因与其他巴贝斯虫HSP20基因具有高度保守性；并验证了该蛋白具有良好的免疫反应原性,可以诱导宿主的体液免疫反应,并可用于东方巴贝斯虫的间接免疫荧光试验；最后分析了该小分子热休克蛋白的分子伴侣活性,提示东方巴贝斯虫HSP20具有重要的功能,为东方巴贝斯虫病的防控和免疫机制研究打下了基础。