[背景及目的]非酒精性脂肪性肝病(Non-alcholic fatty liver disease, NAFLD)是代谢综合征在肝脏的表现,包括单纯性脂肪肝(simple steatosis),非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcholic steatohepatitis, NASH),以及NASH相关的肝纤维化/肝硬化、肝癌。随着生活水平的提高,NAFLD在发展中国家的发病率显著上升,我国NAFLD患者数量在过去的10年增加了近一倍,部分地区的发病率已达四分之一。同时,我国是病毒性肝炎感染的高发地区,约有1亿HBV感染者及4000万HCV感染者,其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趋势,这一部分人群已经引起了研究者们的注意。目前关于NAFLD合并病毒性肝炎的研究多集中在NAFLD合并慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,CHC):NAFLD可以增加CHC患者进展为肝硬化和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的风险,并降低抗病毒治疗的疗效。但是,丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)本身具有致肝细胞脂肪变的作用,因此在NAFLD合并CHC患者中得到的结论可能并不能推而广之。关于NAFLD对慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的影响,目前的研究结果却并不一致,与CHC中看到的现象也不相同。部分研究认为,肝脏脂肪变对CHB具有保护作用：在脂肪肝患者中,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)载量更低,乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)清除率更高。但另一方面,一些研究显示,脂肪肝可能会增加CHB患者发展为肝硬化及HCC的风险,降低恩替卡韦抗病毒治疗的效果。还有一些研究认为,脂肪肝对HBV病毒载量及干扰素抗病毒治疗无影响。事实上,这方面的研究存在许多难点,可能是导致这些矛盾结论的原因。首先,研究中多用肝脏超声诊断脂肪肝。肝脏超声检查仅能检出肝内脂肪沉积超过30%的中度脂肪肝,难以检出轻度脂肪肝(肝脏内脂肪沉积为5%-30%),因此在分组时,可能将轻度脂肪肝患者作为无脂肪肝的对照。其次,在研究NAFLD合并CHB时,难以保证受试者在代谢、病毒、治疗等多种因素上的一致性。第三,人群研究难以获取肝组织观察肝内免疫、代谢等方面的改变。因此,NAFLD在慢性病毒性肝炎中的影响仍不明确。动物模型可以克服上述临床研究中的不足,但目前尚缺乏NAFLD合并病毒性肝炎的动物模型。为了更好的研究NAFLD对慢性病毒性肝炎的影响,本研究的具体研究目标如下：1.成功建立饮食诱导的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型；2.在饮食诱导的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型中,动态观察肝炎病毒的复制情况及肝组织损伤程度；3.探讨NAFLD影响病毒性肝炎病程的相关免疫学机制。[方法]1.采用60%高脂饮食(High fatty diet, HFD)喂养C3H/HeN小鼠12周,观察小鼠一般状态及生活习性改变,观察体重、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、血糖(Glucose,GLU)、胰岛素水平及稳态模型胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance, HOMA-IR)的动态变化及肝脏组织学变化。2.3型鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus-3,MHV-3)腹腔注射感染NAFLD小鼠,观察小鼠一般状态及生存率；动态观察小鼠感染后血清生化学变化及肝脏病理改变；逆转录酶-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测小鼠肝内MHV-3。3.MHV-3腹腔感染NAFLD小鼠及正常饮食(Normal diet, ND)小鼠,比较两组小鼠生存率；比较两组小鼠各时间点血清生化学变化及肝组织病理改变；实时定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测并比较各时间点两组小鼠肝内MHV-3复制情况。4.流式细胞术检测MHV-3感染后各时间点小鼠肝内CD3+CD8+CD69+T细胞、CD3+CD8+PD-1+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的变化,并比较两组小鼠之间的差异；Real-time PCR检测并比较两组小鼠MHV-3感染后各时间点肝内IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-33、TNF-α、Fg12的表达,并比较两组小鼠之间的差异。[结果]1.成功建立NAFLD小鼠模型。HFD饮食喂养12周,C3H/HeN小鼠体型肥胖,皮毛油腻,不喜活动,体重明显增加；外周血ALT及AST水平无显著升高；TG、TC、HDL、LDL、GLU、胰岛素水平及HOMA-IR均显著升高；小鼠肝脏体积增大,肝重高于ND组,边缘圆钝,色泽红黄,表面光滑,有油腻感；肝组织切片HE染色及油红O染色可见肝细胞内大量脂滴形成。2.成功建立饮食诱导的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,在3-12天内出现死亡,死亡率约为20%；感染小鼠外周血ALT和AST水平显著升高；感染小鼠肝脏苍白,缺乏光泽,并可见弥漫分布的针尖样出血点；HE染色除可见肝细胞内脂滴形成,还可见肝细胞胞浆疏松、肝细胞坏死、淋巴细胞浸润等表现；PCR可检测到肝内MHV-3病毒复制。3. NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,生存率与对照组无差异；MHV-3病毒复制高于对照组,于感染4天时有统计学差异(P=0.002); ALT及AST升高幅度大于ND组；肝组织炎症坏死程度交对照组严重。4. NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,肝内IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-33、TNF-α、Fg12表达水平上调,且上调幅度大于ND组小鼠,而IL-22表达水平降低,且降低幅度大于对照组小鼠。5. NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,肝内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例降低,但感染第16天开始高于ND组小鼠；CD3+CD8+CD69+T及CD3+CD8+PD1+T细胞均出现升高,上升幅度大于ND组小鼠,且细胞比例回落后仍持续高于ND组小鼠。[结论]1.本研究采用HFD喂养C3H/HeN小鼠12周成功建立NAFLD小鼠模型,并在此基础上采用MHV-3病毒腹腔感染小鼠,成功建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。为研究NAFLD对病毒性肝炎的影响提供了动物模型,开辟了新的研究途径。2. NAFLD可以加剧肝内MHV-3病毒复制,加重肝内炎症反应。3. NAFLD在病毒性肝炎感染早期可以促进肝内细胞因子的释放,使CD3+CD8+CD69+T比例增加,CD4+CD25+Foxp3+Treg比例降低,可导致肝内炎症坏死加重的。而感染后期CD4+CD25+Foxp3+Treg及CD3+CD8+PD1+T细胞比例的增加,有可能阻碍病毒清除。