论文部分内容阅读
茶树(Camellia sinensis)是世界重要的经济林木之一。由炭疽菌(Colletotrichum spp.)引起的炭疽病可以危害茶树叶部组织,严重影响茶叶产量。利用茶树自身抗病资源,培育抗病新品种是控制茶树炭疽病最经济、有效的措施。目前,关于我国茶树炭疽菌种类及其地理分布尚不清晰。同时,茶树次级代谢物对抗炭疽病的作用也不明确。本文系统研究了我国茶树炭疽菌的生物多样性,并以茶树抗病品种中茶108(ZC108)和感病品种龙井43(LJ43)作为试验材料,对炭疽菌-茶树互作关系进行了较为深入的研究。主要结果如下:1.从我国15个省(市、自治区)的茶叶主产区多个茶树品种病叶上共分离获得106株炭疽菌,基于多基因系统发育学(ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、GS和ITS)和形态学分析,发现这些菌株分别归属于C.acutatum、C.boninense、C.cliviae、C.gloeosporioides和C.truncatum共5个复合种中的11个种,包括6个已知种(C.camelliae、C.cliviae、C.fioriniae、C.fructicola、C.karstii和C.siamense),3个新记录种(C.aenigma、C.endophytica和C.truncatum),1个新种(C.wuxiense)和1个未确定种(Colletotrichum sp.)。C.gloeosporioides复合种的种类最多(7/11),其中C.camelliae和C.fructicola为我国茶树优势致病种。同时,本研究进一步验证了利用ApMat和GS基因快速识别C.gloeosporioides复合种种间关系的方法,结果表明此方法并不能将C.siamense和个别种完全区分,但其依然是快速而有效判断炭疽菌种级关系的重要手段。致病性测试结果表明,C.camelliae、C.aenigma、C.endophytica、C.fructicola和C.truncatum可使LJ43叶片致病,而其他6种(C.cliviae、C.fioriniae、C.karstii、Colletotrichum sp.、C.siamense和C.wuxiense)接种后未发病。2.利用组织透明法观察炭疽菌C.fructicola在不同抗性品种上的萌发侵染情况。结果表明,接种12 h后,炭疽菌C.fructicola在两个品种上均已开始萌发,并形成附着胞,但在ZC108叶片上的孢子萌发数量和附着胞数量明显少于LJ43;接种96h后,炭疽菌C.fructicola在抗病品种上的生长发育明显延迟。3.利用二联基联苯胺和台盼蓝染色法,观察不同抗性品种与炭疽菌C.fructicola互作中H2O2和过敏性坏死(HR)的作用。结果表明,在接种炭疽菌后,两个品种叶片均出现不同程度的H2O2积累和HR反应,但抗病品种比感病品种提前24h响应,并且抗病品种叶片的反应程度比感病品种强,表明活性氧和HR在茶树抗炭疽病过程中发挥着重要作用。4.分别对ZC108和LJ43接种炭疽菌C.fructicola,测定叶片多酚总量、儿茶素类和咖啡碱含量及其相关合成基因的变化。结果表明,(-)-EGCG,(+)-C和咖啡碱含量及其关键基因的表达受到炭疽菌C.fructicola诱导升高;室内抑菌试验结果表明,咖啡碱的抑菌效果要优于茶多酚和儿茶素;电镜观察结果和生理活性测定结果表明,咖啡碱能破坏菌丝的细胞壁和原生质膜;对茶树咖啡碱合成关键基因TCS1和SAMS启动子序列进行分析发现,启动子区域含有多个与植物抗逆性相关的顺式作用元件。综上所述,(-)-EGCG、(+)-C和咖啡碱在茶树抗病过程中发挥了重要作用。5.分别以ZC108和LJ43叶片为材料,对接种炭疽菌C.fructicola后0、24和72h的叶片样品进行转录组测序。结果表明,每个样品测序均获得至少11.75 G clean base;利用Trinity法对2个品种进行独立组装,ZC108共获得59,336条unigenes,LJ43共获得35,310条unigenes;将所有unigenes序列与数据库AtNoPDB比对后进行功能信息注释,ZC108共注释35,935条unigenes,LJ43共注释35,310条unigenes;采用RSEM法筛选差异表达基因,ZC108共获得19,718条差异表达基因,LJ43获得15,848条;对差异表达基因进行GO生物功能分析发现,两个品种的差异表达基因富集到与抗病有关的功能中,但ZC108各通路富集的基因数明显多于LJ43。对差异表达基因进行KEGG富集分析发现,ZC108的差异表达基因主要富集在植物激素合成和咖啡碱代谢通路中,而LJ43主要富集在核糖体通路。以上结果表明植物激素和咖啡碱合成代谢与茶树抗炭疽病有关。