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左旋肉碱即L-肉碱(英文简称:L-car),又叫维生素BT,是一种广泛存在于动物、植物以及部分微生物体内的活性异构体,其主要功能是参与脂肪酸的代谢。近年来,L-肉碱越来越广泛地用于新型的功能食品和降血脂新药的开发,因此,其生产方法和检测都面临更高的技术要求。许多微生物都有能将巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱和D-肉碱(英文简称分别:crot、γ-BB和D-car)等一些物质转化为L-肉碱的能力。本文根据分析大肠杆菌和假单胞菌体内产L-肉碱的代谢过程途径发现,大肠杆菌能转化巴豆甜菜碱和γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱,假单胞菌能将γ-丁基甜菜碱发酵生成L-肉碱。为了进一步提高L-肉碱的产量,从大肠杆菌野生型和假单胞菌野生型出发,构建得到一些稳定过表达产L-肉碱过程中的酶的基因和消除体内不利于产L-肉碱的基因,将这些基因导入大肠杆菌野生性(或突变株)后得到稳定生产L-肉碱的基因工程菌株。本文实验方法:①构建T7启动子控制下的过表达质粒28a-caiBCD和PACYCD-caiT-caiF,转入大肠杆菌BW25113ΔaceK和BL21(DE3)中进行过表达,通过IPTG及厌氧诱导优化酶活和菌体量,然后利用全细胞酶促转化巴豆甜菜碱生产L-肉碱。②构建过表达质粒3087-bbd,将此质粒转入假单胞菌pf5Δcdh中进行过表达,得到工程菌pf5Δcdh/bbd,然后将此工程菌在含有γ-丁基甜菜碱的发酵液中进行发酵产L-肉碱。最后得出:①导入质粒28a-caiBCD和PACYCD-caiT-caiF后得到的大肠杆菌工程菌BW25113AaceK/28a-caiBCD+PACYCD-caiT-caiF(简称BW251 13ΔaceK/caiBCD+caiT-caiF),在生长2h后加IPTG后并在厌氧环境下诱导18h后得到的菌体在含有20g/L的巴豆甜菜碱盐酸盐的转化液中进行转化时,4h后产量达2.219g/L,摩尔转化率在 13%左右。而得到 的工程菌BL21(DE3)/28a-caiBCD+PACYCD-caiT-caiF(简称 BL21(DE3)/caiBCD+caiT-caiF)在生长2h后加IPTG诱导4h后得到的菌体作为粗酶进行转化时,在同样的转化液中进行转化时,最后产量能达8.5g/L左右,摩尔转化率为47%,比野生型提高了 17倍左右;②导入质粒3087-Acdh构建得到的假单胞菌工程菌pf5Δcdh/bbh,在含有γ-丁基甜菜碱的发酵液中进行发酵时,最后产量为1.2 g/L左右,此产量很低,但与假单胞菌本身产量0.2g/L相比,提高6倍。