众所周知,糖皮质激素(glucocorticoids, GC)是调节机体代谢的重要因子大量研究证实,GC促进脂肪细胞分化、增加甘油三酯的合成、抑制脂解,促进脂肪蓄积,导致机体代谢紊乱。体内GC的作用不仅与其血浆水平相关,还和其在局部组织的活性有关。11β-羟化类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)是GC的局部组织放大器,它能将无活性的GC转化为有活性的GC,增强GC的作用。临床研究也发现,代谢综合征患者虽然血清GC的浓度正常,但却因为脂肪中11β-HSD1的水平增高,活化了内源性GC,导致了肥胖、高血糖、高血脂等“类库欣综合征”的发生。因此,GC的作用是机体代谢紊乱的重要原因,搞清GC调节脂肪功能的分子机制可有助于明确代谢综合征的发病原因,从而为代谢综合征的有效防治奠定基础。目前研究发现,与棕色脂肪一样,白色脂肪棕色化也能促进能量消耗、改善机体代谢,增强白色脂肪棕色化已成为治疗机体代谢紊乱的新靶点。GC不仅调控白色脂肪分化,也是调控棕色脂肪功能的重要因子。我们的前期研究也发现,使用GC作用于棕色脂肪细胞后,其特异性的功能基因——解偶联蛋白1(uncoupling protein-1, UCP1)水平明显下调。然而,目前没有关于GC对动物或人体白色脂肪棕色化功能影响的体内外研究报道。因此,本研究是从GC影响白色脂肪的棕色功能出发,筛选出调控白色脂肪棕色化的特异miRNA,研究GC调控白色脂肪棕色化的分子机理,搞清GC影响机体代谢的作用机制。通过进一步的白色脂肪棕色化的体内外研究,为临床有针对地、有效改善机体能量代谢、防治代谢综合征提供新策略。本研究分为两个部分：第一部分：糖皮质激素调控白色脂肪棕色化功能的研究目的： GC是调控棕色脂肪功能的重要因子。早就有研究发现,GC作用于棕色脂肪细胞后,其特异性的功能基因UCP1水平出现下调；相反,当给予GR抑制剂RU486后,其UCP1等棕色功能基因表达量会显著性地增加。我们的前期研究也发现,抑制棕色脂肪细胞的GC活性会显著增加棕色脂肪功能。众所周知,GC是促进白色脂肪分化的关键因子。但是,GC对于白色脂肪棕色化功能影响的研究却仍没有报道。因此,我们的研究旨在明确糖皮质激素对小鼠白色脂肪棕色化功能的影响。方法：在体内研究方面,我们使用有活性的GC——地塞米松干预C57BL/6J小鼠6周,分析糖皮质激素对小鼠白色脂肪形态、棕色化功能基因表达以及整体代谢的影响。体外研究方面,使用不同浓度的地塞米松干预原代棕色脂肪细胞,运用Real-time PCR和Western blot分析GC对白色脂肪棕色化功能基因UCP1表达的影响；在细胞功能方面,我们检测了地塞米松对白色脂肪细胞耗氧量的影响。最后我们通过慢病毒过表达11β-HSD1增强内源性GC活性,进一步验证GC对白色脂肪棕色化功能的影响。结果：体内研究方面,地塞米松干预小鼠白色脂肪的重量和细胞体积显著性增大,同时小鼠棕色脂肪组织的功能基因UCP1显著性下降,进一步免疫组化结果也提示其UCP1表达明显减少,这可能与小鼠糖耐量异常有一定的相关性。体外研究方面,地塞米松显著抑制原代白脂肪细胞UCP1的基因表达,并呈浓度依赖性；在蛋白水平上,地塞米松同样抑制了小鼠白色脂肪细胞的棕色化功能蛋白UCP-1和PRDM16的表达；在细胞功能上,我们进一步发现地塞米松抑制了小鼠白色脂肪细胞的耗氧量。另外,过表达11β-HSD1可以通过增强内源性糖皮质激素活性,进而抑制皮下和内脏脂肪细胞的棕色化功能基因的表达。结论：GC可显著抑制白色脂肪棕色化功能基因的表达,同样11β-HSD1通过增强内源性糖皮质激素活性,也抑制皮下和内脏脂肪细胞的棕色化功能基因的表达。第二部分：糖皮质激素调控白色脂肪棕色化功能的分子机制研究目的：众所周知,WAT是体内能量贮存的形式,摄入的能量越多白色脂肪的体积和数量越多；相反,BAT富含线粒体,通过细胞内的氧化磷酸化作用,消耗机体能量,减少白色脂肪储存。近年来研究发现,与棕色脂肪类似,白色脂肪棕色化也能促进能量消耗、改善机体代谢,目前增强白色脂肪棕色化己成为治疗机体代谢紊乱的新靶点。本课题的第一部分研究结果提示GC抑制了白色脂肪的棕色化功能,同样11β-HSD1增强内源性GC活性也抑制了白色脂肪细胞的棕色化功能。因此,我们进一步深入研究了GC抑制白色脂肪棕色化功能的分子机制。方法：,我们选取外科手术病人的白色脂肪(包括皮下脂肪和内脏脂肪),进行原代脂肪细胞培养,经miRNA芯片分析寻找地塞米松刺激后显著变化的miR-27b。进一步的体内外实验也验证了活性GC地塞米松刺激后miR-27b的表达显著升高,提示我们GC调控了miR-27b的表达。我们使用软件分析发现miR-27b的上游启动子区域有糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response element, GRE)的结合区域,提示GC可能对miR-27b有着直接调控作用,我们通过Chip分析检测GC是否通过GR与miR-27b启动子的结合。与此同时,我们己采用TargetScan、MiRanda和PicTar数据库预测出miR-27b影响白色脂肪棕色化的可能靶基因。为了验证miR-27b能够作用其可能的靶基因PRDM16,我们分析了干涉/过表达：niR-27b后PRDM16蛋白的改变,并采用荧光素酶报告基因(luciferase reporter gene)共转染技术进行靶基因验证。为了进一步明确miR-27b是通过PRDM16调控白色脂肪棕色化功能,我们在干涉miR-27b的基础上,使用含有PRDM16干涉片段的慢病毒感染原代脂肪细胞抑制PRDM16表达,分析白色脂肪细胞的棕色化功能的情况。最后,我们采用C57BL6/J小鼠建立GC刺激后干涉：niR-27b的动物模型,在体内进一步观察miR-27b在白色脂肪棕色化功能及整体代谢等方面的影响。结果：基因芯片筛选人原代脂肪细胞地塞米松刺激后变化明显的miRNA: miR-27b。在人和小鼠原代脂肪细胞中,糖皮质激素增强miR-27b的表达,验证了基因芯片的结果。糖皮质激素通过活化GR与miR-27b启动子的结合,影响miR-27b的表达。不仅是在基因蛋白水平上,而且在细胞功能水平上,我们的结果均提示过表达：niR-27b明显抑制白色脂肪的棕色化功能,干涉miR-27b增强白色脂肪的棕色化功能。即miR-27b调控了白色脂肪细胞的棕色化功能。niR-27b通过作用靶基因PRDM16调控白色脂肪的棕色化功能。体内实验进一步验证了miR-27b对糖皮质激素在白色脂肪棕色化功能中起重要的调控作用,从而影响机体的整体代谢。结论：GC抑制了白色脂肪的棕色化功能的分子机制可能为：GC通过调节miR-27b的表达,抑制其靶基因PRDM16的作用,进而降低了白色脂肪的棕色化功能