草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）是草鱼出血病的病原体，隶属于水生呼肠孤病毒属，是目前发现的致病性最强的水生呼肠孤病毒。该病毒主要引起草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90％，给我国的水产养殖业造成了巨大的损失。　　目前，对草鱼出血病最为有效的预防方式是疫苗免疫。灭活疫苗、减毒疫苗都已经进入应用阶段，但这些疫苗生产周期长、生产成本高、免疫过程费时费力，使其应用范围受到了限制。因此，研究一种更加简单、可靠、有效的新型疫苗对草鱼出血病的防治具有重要意义。　　酵母细胞是理想的真核表达载体，相对于原核表达载体，酵母细胞具有类似高等动物细胞的糖基化修饰过程，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质。同时，酵母表达系统操作简单，成本低廉，可进行大规模发酵，是理想的重组真核蛋白质的表达系统。除此之外，酵母细胞壁的多糖成分是天然的佐剂，酵母细胞中表达的外源蛋白质和酵母细胞壁组分一起免疫时能增强免疫反应。　　酵母表面展示技术即利用基因工程手段将外源蛋白质的基因与酵母细胞壁基因融合，外源蛋白质在酵母细胞中表达并分泌到细胞外，以融合蛋白的形式展示到酵母细胞的表面。酵母细胞表面展示系统具备酵母表达系统和表面展示系统的双重优点，表达后的外源蛋白具有真核生物的翻译后修饰，同时也分布在酵母细胞的表面，无需纯化直接用于后续研究和应用。　　本研究利用酵母表面展示技术将GCRV外壳蛋白VP7展示到酵母细胞的表面，并对小鼠和草鱼进行了免疫，成功检测到了特异识别VP7蛋白的抗体，通过对酵母表面糖基化基因的改造，提高了酵母表面展示蛋白的免疫诱导性，所获结果如下:　　利用噬菌体展示技术淘选到特异识别草鱼IgM恒定区的单链抗体，其中编号P1D3的单链抗体对草鱼IgM抗体识别能力最强，为后续研究测定草鱼血清IgM的含量提供了有效的工具。　　分别从GCRV-873和GCRV-Ⅱ毒株中克隆了VP7基因并实现了原核表达，制备了特异识别VP7蛋白的鼠源多克隆抗体，为后续研究检测病毒和VP7提供了有效的工具。　　将上述两种毒株的VP7分别展示在酵母表面，并对小鼠和草鱼进行了免疫，获得了特异识别VP7的抗血清，最为关键的是检测到特异识别VP7的草鱼IgM抗体，为利用酵母表面展示技术制备草鱼出血病疫苗奠定了坚实的基础。　　为了更好地将外源蛋白质暴露在酵母细胞表面，敲除酵母糖基化基因可获得有相对较低的超糖基化作用和更多孔细胞壁的酵母突变菌株。通过同源重组技术，分别敲除酵母细胞超糖基化相关的Mnn1、Mnn9、Och1三个基因，并且成功将VP7展示到了突变株的表面。Mnn1基因敲除后酵母细胞形态和生长速度未见明显改变，并能诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体，而Mnn9和Och1基因敲除后，严重影响到酵母细胞的生长，只能诱导小鼠产生较低水平的特异性抗体。上述突变株免疫草鱼后，在草鱼抗血清中没有检测到特异性抗体。　　由于GCRC-873毒株在经过多次传代以后不再感染草鱼，我们不能用计算草鱼死亡率的方式检测疫苗的有效性，只能在草鱼细胞上做病毒中和实验。病毒中和实验的结果表明，原核表达的VP7蛋白免疫草鱼以后得到的血清不能中和病毒感染草鱼细胞，感染病毒的草鱼血清可以中和病毒感染草鱼。野生型酵母菌和Mnn1突变株酵母表面展示的VP7蛋白未能诱导小鼠产生中和病毒的抗体，而Mnn9突变株诱导产生的抗体可以中和病毒感染细胞。后续的病毒中和实验表明，抗血清对病毒的中和能力随着抗体浓度的变化而变化，当抗血清的稀释度为1∶50时，对细胞的保护效率达到66.7％。　　综上所述，本研究通过酵母展示技术，在制备新型抗草鱼病毒性出血病疫苗的研究上迈出了艰难的一步。所获得的展示VP7的Mnn基因缺失突变酵母菌能够诱导小鼠产生中和性抗体，虽然在诱导草鱼产生中和抗体方面还未能获得满意的结果，离有实际功效的口服疫苗还相差甚远，但已为进一步的研究打下了良好的基础。