【摘 要】
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目的研究microRNA-637（miR-637）在多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）患者骨髓标本及MM细胞株（U266和RPMI8226）中的表达。通过LipofectamineTM3000脂质体转染miR-637 mimics和inhibitors,构建转染NUPR1过表达慢病毒的MM细胞株,探讨miR-637靶向NUPR1对MM细胞增殖、凋亡与自噬的作用及机制研究。方法1
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目的研究microRNA-637（miR-637）在多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）患者骨髓标本及MM细胞株（U266和RPMI8226）中的表达。通过LipofectamineTM3000脂质体转染miR-637 mimics和inhibitors,构建转染NUPR1过表达慢病毒的MM细胞株,探讨miR-637靶向NUPR1对MM细胞增殖、凋亡与自噬的作用及机制研究。方法1.收集36例初诊MM患者、21例健康成人骨髓标本。提取骨髓单个核细胞。2.体外细胞实验:采用q RT-PCR和Western blot,检测初诊MM患者骨髓单个核细胞和MM细胞株（U266和RPMI8226）miR-637表达。四个生物信息学数据库分析表明,miR-637与NUPR1相互关联。本实验采用双荧光素酶实验验证miR-637与NUPR1相关性。通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验观察MM细胞增殖能力的情况,细胞凋亡、自噬水平是通过流式、Western blot的方法进行检测,蛋白质印迹分析用于检测PTEN,p-AKT和AKT通路蛋白。结果1.初诊MM患者骨髓标本miR-637低表达:与健康成人比较,初诊MM患者骨髓标本miR-637表达降低。2.miR-637抑制MM细胞增殖、自噬,促进细胞凋亡:分别转染mimics NC（nonspecific control）、miR-637 mimics,inhibitor NC和miR-637 inhibitors至MM细胞。验证miR-637 mimics、inhibitors的转染效率采用q RT-PCR及绿色荧光显微镜验证。检测miR-637在1至5天的细胞增殖能力采用CCK-8实验研究方法,结果表明miR-637mimics较NC组细胞增殖能力低;相反的是,转染miR-637抑制剂后,MM细胞增殖能力增强。V/PI染色观察U266和RPMI8226细胞,miR-637 mimics凋亡率显著增加。转染miR-637 mimics后,细胞凋亡指标Bax、cleaved caspase 3和自噬指标p62表达增加,而细胞凋亡指标Bcl2、自噬指标LC3比率降低。3.MM细胞中miR-637靶向NUPR1:通过生物信息学预测分析和双荧光素酶实验检测,结果表明NUPR1是miR-637潜在靶标。在蛋白表达水平,转染miR-637模拟物后显著降低NUPR1的表达;相反,脂质体转染inhibitors后,我们发现NUPR1表达水平显著增加。初诊MM患者骨髓标本NUPR1表达水平显著高于健康成人,初诊MM患者骨髓标本NUPR1与miR-637呈负相关性。4.NUPR1介导miR-637对MM细胞的作用:NUPR1-LV转染U266、RPMI8226细胞株,绿色荧光显微镜检测NUPR1过表达病毒转染率。结合CCK-8、流式细胞术、Western blot等实验,研究结果表明转染NUPR1-LV后,miR-637对MM细胞增殖、凋亡具有抑制作用,而对自噬有促进作用。5.miR-637靶向NUPR1通过PTEN/AKT通路调控MM细胞凋亡及自噬:转染miR-637 mimics后MM细胞PTEN降低;磷酸化AKT表达增加,而总AKT表达无明显变化。结论1.miR-637在多发性骨髓瘤患者标本单个核细胞中低表达。2.miR-637通过调控NUPR1,抑制MM细胞的增殖能力、自噬情况,促使MM细胞发生凋亡作用。3.miR-637是影响MM发生发展的又一分子机制。
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