本文主要从以下几个方面展开： 第一部分： Tet-on系统诱导表达人突变A30P α-synuclein转基因小鼠的构建 目的：构建Tet-on系统诱导表达人突变A30P α-synuclein转基因小鼠。 方法：通过RT-PCR方法从人胎脑中克隆野生型SNCA基因,T-A克隆并测序，并利用单核苷酸差异引物定点诱变构建致病突变Ala30Pro的SNCA基因，采用双酶切法构建含Ala30Pro致病突变基因的pTRE2-syn载体，酶切鉴定，并测序。利用Tet-on系统，采用显微注射法，同时将pTRE2-syn目的基因和pBC-rtTA调控基因注入FVB小鼠受精卵的雄原核中，注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体，取21日龄的断乳小鼠剪尾法提取DNA，经PCR检测获得阳性转基因小鼠，基因测序验证A30P的突变位点。 结果：电泳结果显示RT-PCR方法成功克隆了SNCA基因的cDNA序列，目的基因为481bp；含致病突变Ala30Pro的SNCA基因的pTRE2-syn载体经Bam HI和HindⅢ双酶切鉴定正确，测序结果也显示编码α-突触核蛋白第30位氨基酸的密码子由GCA突变为CCA,其相应编码的氨基酸由Ala突变为Pro；经PCR检测检测共得到rtTA和A30P突变型α-synuclein双阳性转基因F0代小鼠1只，A30P突变型α-synuclein单阳性转基因F0代小鼠13只。 结论：成功构建了受强力霉素调控的高表达A30P突变型α-synuclein Tet-On转基因小鼠。 第二部分：人突变A30Pα-synuclein转基因小鼠行为学特性的研究 目的：通过强力霉素(DOX)诱导，使人突变A30P α-synuclein基因大量表达，观察突变基因表达后小鼠运动功能的行为学变化。 方法：双阳性转基因FVB小鼠，每组15只，并设双阴性对照组15只，均于强力霉素1.5mg/ml饮水诱导。分别在诱导2周、诱导4周和诱导8周时对各组动物的行为学指标进行动态观察。小鼠转棒仪测定小鼠转棒潜伏期；小鼠自发活动箱测定小鼠自发活动量；自制小鼠爬杆测定爬杆时间。 结果：诱导2周组与双阴性对照之间的自发活动、转棒潜伏期及爬杆时间没有统计学意义；诱导满4周后小鼠的自发活动、转棒潜伏期比阴性对照要明显减少，爬杆时间明显增加(p<0.01)；诱导满8周的小鼠自发活动最少，转棒潜伏期最短，而相应的爬杆时间最长。 结论:强力霉素诱导对转基因小鼠的运动功能存在显著影响。诱导4周的时候较为明显，并在4周后随着诱导时间的延长出现症状越来越重。 第三部分：人突变A30P α-syunclein转基因小鼠PD模型的建立与初步鉴定 目的：转基因FVB小鼠诱导后出现运动功能的变化，诱导4周后运动功能明显衰退，为探讨这一现象，进一步观察突变α-synuclein表达情况以及相应的解剖病理基础。 方法：双阳性转基因FVB小鼠，每组15只，并设双阴性对照组15只，均于强力霉素1.5mg／ml饮水诱导。分别以Western-blotting和RT-PCR法检测诱导2周、4周和8周时α-synuclein蛋白表达及mRNA水平。小鼠黑质连续切片，酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫组织化学染色并观察TH阳性细胞数的变化。 结果:强力霉素诱导后，α-synuclein在小鼠的小脑、脑干、海马、皮层均有表达，海马、皮层表达更多，诱导满4周后，脑干α-synuclein表达明显增加，8周后增加更明显。转基因小鼠α-synucleinRNA水平在脑、肺、肝、脾、肾、胃、肠、胸腺均有表达，而心脏基本没有表达，各脑区α-synucleinRNA在强力霉素诱导4周后为显著。4周时，黑质TH细胞显著减少，8周后减少更明显。 结论:转基因FVB小鼠通过强力霉素诱导后，脑干α-synuclein大量表达，黑质TH阳性细胞数显著减少。