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研究背景经过100多年的研究,肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)在肝脏病理、生理中的作用已基本证实。HSC的活化是肝纤维化发生发展的中心环节。肝纤维化的形成是一个多因素的复杂过程,不同病因引起纤维化的早期都有HSC的活化,这是纤维化形成的主要细胞基础。HSC一经激活,表型转换形成肌成纤维细胞(myofiroblast,MFB),分泌大量的细胞外基质(extracellular marix,ECM),并引起基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMPs)和金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)平衡失调及抑制HSC凋亡的发生,活化的肝星状细胞还能向损伤区迁移,使损伤区纤维化,因此肝星状细胞活化合成大量细胞外基质是肝纤维化形成的直接原因,也是肝纤维化发生的核心环节。肝硬化是发生肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的主要危险因素,大部分HCC患者具有慢性肝病、肝硬化的背景。激活的HSC可位于肿瘤基质内,与肿瘤细胞之间存在密切的相互关系。近年来研究表明活化的星状细胞广泛存在于肝癌的间质中,作为肿瘤微环境的一部分,对肝癌的发生、发展及侵袭也起到一定作用。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一类由多种细胞分泌产生,具有广泛的生物学活性细胞因了,与生长、发育、癌症发生等密切相关,涉及多种生理及病理过程。PDGF目前被视为HSC最强的促增值因子,能够强烈刺激HSC激活、增值及迁移,转化为肌成纤维细胞,促使其胶原的产生和沉积,在肝纤维化发生、发展中起着非常重要的作用。神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1, NRP-1)是1987年发现的新型细胞膜表面Ⅰ型跨膜糖蛋白,最初的研究显示Neuropilin为semaphorin家族受体,可与轴突生长导向因子sema3A结合,在神经发育时,参与轴突导向、神经纤维成束、细胞迁移以及成人神经细胞的损伤修复等重要过程,后来研究结果显示NRP-1广泛表达于内皮细胞和肿瘤细胞,可作为VEGF165及与血管新生相关的其它几种VEGF家族成员的受体。目前研究表明NRP-1广泛存在人体组织中,对某些疾病的发生、发展起着重要的作用。关于NRP-1的研究也已从最初神经系统发育扩展至血管形成、肿瘤发生与发展、造血系统疾病、消化系统疾病、免疫系统功能等多领域,尤其是其在肿瘤及血管生成方面的研究逐渐成为热点。近年来不断有研究证实NRP-1可增强PDGF对细胞的作用,并认为NRP-1可能为PDGF的协同受体或共受体。部分学者在人肝硬化及小鼠肝硬化模型标本中活化的星状细胞上,发现高表达的NRP-1,并与血小板衍生生长因子受体-ββ(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR-ββ)表达有相关性。也有研究发现NRP-1表达在肝周内皮细胞,肝癌细胞,但在正常的肝细胞没有表达NRP-1。这些资料表明NRP-1在肝脏的疾病中有着重要作用。RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA)被导入细胞后,可导致该内源性mRNA发生特异性的降解,从而导致该基因表达的沉寂,产生相应的功能缺失,是一种在转录后使基因表达的沉默的现象(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。目前该技术已广泛应用于生物学实验。目前国外关于NRP-1对肝脏疾病作用的研究还非常少见,国内尚未见相关文献报道。本研究利用RNA干扰方法抑制NRP-1表达后,观察PDGF-BB对肝星状细胞的作用,为进一步探索NRP-1对肝脏的病理、生理研究做好铺垫。目的：观察siRNA抑制NRP-1后对PDGF-BB刺激肝星状细胞活化、增殖及迁移作用的影响。为探索NRP-1在肝硬化、肝癌的作用提供理论基础以及为肝硬化、肝癌的治疗提供新的靶点。方法：1.采用免疫荧光双重染色方法检测NRP-1及PDGFR-ββ在肝星状细胞LX2的表达。2.将化学合成针对NRP-1的siRNA及阴性对照siRNA转染至LX2内,将细胞分为阳性干扰组(A组)、阴性干扰组(B组)、正常对照组(C组),实时荧光定量PCR检测各组不同时段NRP-1mRNA的表达及West-blot检测各组不同时段NRP-1蛋白的表达。3.于转染24小时后向A组、B组、C组加入PDGF-BB(终浓度为20ng/m1)孵育细胞,然后进行如下操作：(1)24小时后逆转录PCR检测三组细胞α-SMA mRNA的表达。(2)12小时后用CCK8法检测LX2的增殖情况。(3)划痕实验检测LX2的迁移能力。4.统计学方法本课题采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计学处理和分析,计量资料以均数士标准差(x士s)表示。多组均数比较采用单因素方差分析(One--Way ANOVA),若方差齐性取F值,若方差不齐则采用Welch法,组间比较在方差齐性时采用Bonferroni检验,方差不齐时采用DunnettT3法,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.免疫荧光双重染色显示NRP-1及PDGFR-ββ共同在LX2细胞膜上广泛表达。2.实时荧光定量PCR提示A组转染siRNA后24小时、48小时的NRP-1mRNA表达量较B组相同时间段的表达量及C组的表达量明显下降,差异均有统计学意义(P=0.000),B、C组间无显著差异(P=0.120,P=1.000)。转染72小时后,A组NRP-1mRNA表达量逐渐恢复,与B、C三组间均未见显著差异(F=0.800,P=0.492)。3. West-blot结果显示A组转染siRNA后24小时、48小时的NRP-1蛋白的相对表达量较B组相同时间段的表达量及C组的表达量明显下降,差异有统计学意义(P=0.000),B、C组间无显著差异(P=1.000,P=1.000)。转染72小时后,A组NRP-1蛋白的相对表达量逐渐恢复,与B、C三组间均未见显著差异(F=0.303,P=0.750)。4. RT-PCR检测加入PDGF-BB24h后三组细胞的α-SMA mRNA的表达有差异(F=33.492,P=0.001)。与B组及C组相比,A组mRNA的表达值显著下降,差异均有统计学意义(P=0.001,P=0.001)。B组及C组之间mRNA的表达值并无显著差异(P=1.000)5.CCK8法检测三组OD值经方差齐性检验P=0.039,说明方差不齐,用近似F检验的Welch法检验P=0.007,采用Dunnett T3法行组间比较,结果显示：与B组及C组相比,A组OD值显著下降,差异均有统计学意义(P=0.019,P=0.019)；B组及C组之间OD值并无显著差异(P=0.982)。说明A组细胞增殖明显受到抑制。6.细胞划痕实验结果显示,加入PDGF-BB48h后,A组细胞迁移率为(67.83±2.44)%,B组及C组细胞迁移率为(89.26±0.30)%、(88.46±1.98)%,单因素方差分析结果表明三组细胞数有统计学差异(F=132.732,P=0.000),组间Bonferroni法检验结果表明A组细胞迁移能力与B组及C组细胞明显减弱,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。B组及C组细胞之间比较无显著区别(P=1.000)。说明NRP-1基因沉默后减弱了PDGF-BB对星状细胞的迁移作用。结论：NRP-1及PDGFR-ββ共表达于肝星状细胞膜,下调NRP-1的表达可抑制PDGF-BB刺激肝星状细胞活化、增殖及迁移的作用。