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目的体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞系（TKE2），建立高浓度葡萄糖诱导的小鼠角膜上皮细胞凋亡模型，通过添加substance P（SP），研究SP对高糖环境下小鼠角膜上皮细胞凋亡的影响，并分析可能的信号通路。方法1.高糖诱导小鼠角膜上皮细胞凋亡模型的建立：应用小鼠角膜上皮干/祖细胞系（TKE2）作为体外细胞实验的模型，在KSFM培养基中培养TKE2细胞，行如下实验：（1）高糖诱导TKE2细胞凋亡的浓度梯度：TKE2细胞分别采用0、50、150、250、350mM葡萄糖处理24h，采用Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测分析细胞凋亡比例，确定高糖诱导TKE2细胞凋亡的最适葡萄糖浓度。（2）高糖诱导TKE2细胞凋亡的时间梯度：根据（1）中结果选定最适高糖浓度，分别处理TKE2细胞0、12、24、48h，采用Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测分析细胞凋亡比例，确定高糖诱导TKE2细胞凋亡的最适时间。2. SP抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡模型的建立：在方法1结果建立的高糖诱导TKE2细胞凋亡模型中分别添加0.1、1、10μM SP进行预处理2h，采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，确定SP对TKE2细胞凋亡的影响及其最佳浓度。3.探讨SP抑制细胞凋亡可能的信号通路：根据方法1和2中结果确定高糖浓度、SP浓度及处理时间，分析SP抑制细胞凋亡可能的信号通路：（1）与NK-1R信号通路的关系：在细胞培养过程中，通过添加NK-1R抑制剂L-733,060(1μM)预处理，而后通过Annexin V/PI双染、Caspase活性检测试剂盒检测细胞凋亡情况；（2）与Akt信号通路的关系：在细胞培养过程中，通过添加Akt抑制剂(40μM)预处理，而后行Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，Western blot检测P-Akt、总Akt的表达。（3）与氧化应激通路的关系：在细胞培养过程中，高糖组中分别添加NAC (1mM)和DPI (1μM)两种阳性抗氧化剂预处理，与SP组平行实验，而后行ROS染色、钙离子荧光探针（Fluo-3AM）染色和线粒体膜电位荧光探针（JC-1）染色检测分析细胞活性氧水平、细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位变化情况。结果1. HG可诱导TKE2细胞发生细胞凋亡，以晚期凋亡为主，具有浓度和时间依赖性。当葡萄糖浓度分别为0、50、150、250、350mM时，TKE2细胞凋亡比例分别为5.60%、4.87%、7.97%、44.62%、95.51%。当用相同浓度葡萄糖分别处理0、12、24、48h时，各组细胞凋亡比例分别为6.33%、13.94%、45.11%、66.99%。当葡萄糖浓度为250mM、处理时间为24h时，TKE2细胞凋亡模型最理想。2. SP可抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡，存在浓度依赖性。当SP浓度分别为0、0.1、1、10μM时，TKE2细胞凋亡比例分别为44.53%、30.23%、16.95%、21.41%。当SP浓度为1μM时，其抑制细胞凋亡的作用最显著。3. SP发挥抑制细胞凋亡可能的信号通路：（1）SP-NK-1R信号通路：向SP组中加入NK-1R抑制剂L-733,060(1μM)后，流式分析结果示HG、HG+SP、HG+SP+NK-1R抑制剂组细胞凋亡比例分别为33.78%、15.68%、34.32%，加入NK-1R抑制剂组细胞凋亡比例较SP组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。caspase3、8、9活性检测结果示：SP组与高糖组相比caspase3、8、9表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）,SP组中加入Nk-1Ri，caspase8、9表达与SP组无明显差异（P>0.05），caspase3表达明显升高，与高糖组无差异(P>0.05)。（2）Akt信号通路：向SP组中加入Akt抑制剂(40μM)后，流式分析结果示HG、HG+SP、HG+SP+Akt抑制剂组细胞凋亡比例分别为46.70%、15.39%、29.43%，加入Akt抑制剂后，细胞凋亡比例明显高于SP组，但仍低于高糖组，各组差异均有统计学意义（P<0.01）。Western Blot结果示：高糖组、NK-1R抑制剂组及AKt抑制剂组P-Akt表达水平较对照组及SP组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01），SP组与对照组无差异（P>0.05）。各组总Akt表达差异无统计学意义（P>0.05）（3）氧化应激相关通路：高糖处理组中分别加入抗氧化剂NAC和DPI，SP组、NAC组、DPI组与高糖组相比，ROS表达减弱、细胞内钙离子浓度降低，线粒体膜电位升高，各组差异均有统计学意义（P<0.01）。高糖组、NK-1Ri组、Akti组三组差异无统计学意义（P>0.05）。结论高浓度葡萄糖可以诱导体外培养的小鼠角膜上皮干/祖细胞系（TKE2）细胞发生细胞凋亡。SP可以抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡。SP抑制细胞凋亡的作用与其通过NK-1R受体，激活Akt信号通路，抑制细胞的氧化应激反应有关。