药物成瘾是在遗传和环境因素共同作用下,成瘾性药物引起机体发生的一种慢性复发性脑疾病,具有明显的社会和心理学特征。《2020年世界毒品报告》显示,全球登记在册吸毒人数约有2.7亿人,其中有近3500万人成瘾,而直接死于毒品滥用的人数近60万。我国2020年6月最新发布的《2019年中国毒品形势报告》指出,虽然中国毒品滥用形势好转,但实际药物成瘾患者人数较多,仍存在吸毒活动隐蔽性强、新型毒品增多、对吸毒的治理巩固难度加大等重大风险隐患。药物成瘾不仅给患者本人及其家庭带来严重危害,同时还会引发艾滋病、结核和肝炎等重大传染病的流行,引发违法犯罪行为,最终造成巨大的经济损失,严重威胁国家安全和社会稳定。从医学生物学角度而言,人体对毒品的易感性和高复吸（成瘾者经脱毒治疗后,半年内复吸率高达95%以上）是造成药物成瘾巨大危害的根本原因。然而令人遗憾的是,由于药物成瘾复吸的神经生物学机制尚未阐明,目前尚无理想防复吸药物或干预手段。因此,尽快全面认识成瘾复吸的神经生物学机制,是成功研发理想的防复吸药物和其他有效干预技术的迫切需求。长期大量的临床研究发现,诱发成瘾复吸的主要因素有三类,分别是线索、成瘾性药物以及负性应激。其中,线索是最常见和最重要因素。根据巴普洛夫条件反射经典理论,线索是指自然环境的中性刺激（视觉、听觉、触觉及嗅觉等感官刺激）与成瘾性物质在时间和空间上反复偶联后,中性刺激可转化成为相关线索。成瘾医学生物学的研究认为,线索在成瘾发展过程中发挥了重要推动作用,主要是因为成瘾相关线索具备了以下三个重要特征:①自身被赋予了奖赏价值,维持了用药行为;②促进了强迫性用药行为的形成;③成瘾行为消退后,能诱发强烈渴求状态导致复吸行为的出现。因此,阐明线索诱发复吸的神经生物学机制是解决临床药物成瘾问题的关键环节,具有极为重要的科学意义和应用价值。对于成瘾致病过程的研究,目前多数研究认为,线索诱发成瘾复吸主要是由冲动控制功能减弱造成的,而内侧前额叶皮层（medial prefontal cortex,mPFC）到伏隔核（nucleus accumbens,NAc）的谷氨酸（glutamate,Glu）投射通路是的最终公共通路。然而令人遗憾的是,迄今,基于该假说研发的药物并未彻底解决临床中线索诱发复吸问题。因此,这一结果提示,在线索诱发成瘾复吸的过程中,mPFC-NAc的谷氨酸神经投射通路并非最终通路或唯一调控通路,可能还存其他神经调控机制。中脑边缘皮质多巴胺系统是机体的奖赏中枢,调控了奖赏、动机、学习等重要生理功能,是机体趋利避害的神经结构和物质基础。中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area,VTA）是核心脑区。在构成此脑区的神经元中大约有70%是多巴胺（dopamine,DA）能神经元,其神经纤维分别投射到前额叶皮层、伏隔核、杏仁核以及海马（hippocampus,HIP）等脑区,通过向靶脑区释放DA神经递质介导其功能的实现。成瘾性药物的化学结构千差万别,各自有不同的作用靶点,但各类成瘾性药物却均可直接或者间接上调VTA-NAc的DA神经通路功能,引起NAc脑区突触间隙内多巴胺神经递质浓度快速升高,产生强烈正性强化作用（欣快感）,从而启动成瘾行为的出现。本课题组前期以中脑边缘皮质多巴胺系统为核心,将光遗传学技术与成瘾研究的金标准模型自身给药实验相结合,建立了自身给光模型技术平台,该模型可作为成瘾研究的行为学范式,有助于理解和阐明物质及非物质成瘾形式（如性成瘾、网络成瘾等）背后的神经机制。采用该模型,我们前期的研究发现成瘾相关线索的形成是由VTA-DA神经系统的激活而实现的,在消退训练后,线索通过激活VTA的DA能神经元诱发强烈心理渴求,进一步依赖于VTA-NAc core神经环路直接诱导复吸行为的出现。所以我们提出“VTA-DA神经系统可直接介导线索诱发的强烈心理渴求导致成瘾复吸行为”这一科学工作假说。围绕这一假说,本课题研究将就“线索是通过怎么样的神经调控通路精准地激活VTA这一皮层下的深部脑核团并介导其特异性功能的发挥”这一科学问题开展深入研究。回答这些科学问题不但有益于全面、正确地认识线索诱发成瘾复吸的神经生物学机制,还对研发成瘾复吸的干预策略具有重要科学意义和应用价值。机体接受环境刺激信息有80%以上是通过视觉完成的,因此本课题以视觉线索为研究对象,采用自给光的成瘾模型,阐明视觉线索诱发成瘾复吸的神经通路调控机制。灯光通过视神经激活初级感觉核团,之后传入视觉皮层进行信息整合后产生视知觉。最新的研究发现,视觉信号可通过刺激初级感觉核团-上丘（superior colliculus,SC）直接激活VTA脑区的GABA能和DA能神经元介导本能恐惧和习得性恐惧的发生。另外,还有研究提示,在经过正性强化学习（reinforcement learning）后,大脑初级触觉感觉皮层的神经元可直接对线索刺激做出反应,计划随后的行为反应,并不需要高级中枢决策中心的参与。基于以上现有研究,我们推测,在特异性激活VTA-DA能神经元建立的成瘾行为范式中,经过联合学习的过程,灯光刺激被赋予奖赏激励价值成为相关线索,初级感觉核团SC可能是线索诱发VTA脑区激活进而诱导复吸行为的初始脑区。因此,本课题采用自给光的成瘾行为范式,研究SC对VTA的直接调控作用,揭示视觉线索诱发VTA脑区激活的神经调控通路机制。具体研究方法和结果如下。实验方法本实验以DAT-Cre小鼠为主要研究对象,采用病毒示踪技术和自给光的成瘾行为范式,分别从神经投射和功能调节两方面开展研究。首先,在神经投射结构研究中,采用顺行非跨突触病毒和逆行跨单突触狂犬病毒的荧光示踪技术,明确上丘和中脑腹侧被盖区在解剖结构上的直接相互投射。然后,在神经环路调控功能研究中,采用自给光模型的成瘾性行为范式,在DAT-Cre小鼠的VTA脑区注射携带光敏感通道蛋白ChR2（channelrhodopsin-2）的病毒,使得多巴胺能神经元特异性表达ChR2;在SC脑区注射携带谷氨酸能神经元特异性激活型（CaMKⅡα-hM3Dq-GFP）或者抑制（CaMKⅡα-hM4Di-GFP）的化学遗传学病毒,将其特异性表达在SC的Glu能神经元上。将激光刺激光纤导管埋置VTA脑区,通过激光激活光敏感通道蛋白ChR2诱发DA神经元的放电,训练小鼠建立自给光的成瘾性行为范式,在消退训练期之后,通过化学遗传学技术,在VTA脑区注射氯氮平氮氧化物（clozapinenitrogen oxide,CNO）通过作用于特异的激活型或抑制型蛋白激活或抑制SC-VTA的谷氨酸能投射通路,观察其对线索诱发觅光复吸行为的影响。研究结果1、上丘（SC）与中脑腹侧被盖区（VTA）的神经投射通路研究神经解剖结构是功能发挥的物质基础。虽然已有研究表明,SC脑区对VTA脑区存在直接投射,提示灯光等视觉线索是有可能通过激活SC对VTA脑区的神经投射通路发挥作用。然而,由SC投出的神经投射支配了多个脑区,并非在SC激活的时候会同时激活下游所有脑区,那么为何在成瘾行为中的灯光线索会特异性激活SC对VTA的神经投射?我们推测,有一种可能是VTA内的DA能神经元也对SC脑区存在直接的神经投射,在成瘾行为形成的同时,VTA中激活的DA能神经元将线索的奖赏信息直接投射回SC脑区,使得SC脑区的神经元发生可塑性变化,赋予灯光线索奖赏激励价值。因此,这样的双向神经投射的神经结构构成了灯光视觉线索与奖赏性物质之间联合学习记忆的基础。所以,在该部分研究中,我们采用病毒示踪技术明确了在本实验体系中,SC对VTA和VTA对SC的神经投射类型。（1）SC对VTA的谷氨酸神经投射顺行示踪:采用脑立体定位手术在DAT-Cre小鼠的单侧SC脑区注射顺行非跨突触病毒AAV-CaMKⅡα-ChR2-EYFP。在前脑中,CaMKⅡα特异地表达在兴奋性神经元（即谷氨酸能神经元）中。因此该病毒可将光敏蛋白ChR2和荧光蛋白EYFP特异性地表达在SC脑区的谷氨酸能神经元上。同时根据光敏蛋白单向投射表达的特性,可在该类神经元投射靶脑区检测到荧光蛋白的表达情况,从而确定SC的谷氨酸能神经元的直接下游投射脑区。在病毒注射完成后,将小鼠放回饲养间,经过三周的表达后,进行大脑的灌流取材,制作冰冻切片。采用激光共聚焦或荧光显微镜,观察到以上示踪蛋白在SC脑区及VTA脑区的荧光表达,明确了在本实验体系条件下SC对VTA脑区存在特异性投射。逆行示踪:为了进一步确定SC对VTA投射支配的神经元类型,我们采用了逆行跨单突触的病毒示踪方法。以DAT-Cre小鼠为研究对象,基于Cre-LoxP系统,将带有DIO启动子的TVA及G蛋白辅助病毒注射在VTA脑区,使其特异性地表达在VTA的DA能神经元上,三周后在同一位点注射用EnvA包装的RV病毒,一周后进行大脑取材和冰冻切片的制作。然后,采用激光共聚焦或荧光显微镜观察到:在SC中深部存在由VTA的DA能神经元特异性表达的逆行荧光蛋白,而视觉刺激作用的经典核团外侧膝状体（lateral geniculate nucleus,LGN）和初级视觉皮层（primary visual cortex,V1）均未检测到该荧光蛋白的表达。因此,在本实验体系的研究下发现,SC对VTA的神经投射直接支配DA能神经元,但LGN或V1对VTA的DA能神经元未检测到直接的神经投射。该研究结果与在前期在视觉本能恐惧神经调控通路的研究结果相一致。（2）中脑腹侧被盖区对上丘的多巴胺神经投射在以上研究明确了 SC对VTA的DA能神经元的特异性神经投射后,我们进一步研究了 VTA脑区对SC脑区的直接神经投射,为视觉线索与成瘾性奖赏的联合学习记忆过程提供可能的神经结构基础。在小鼠的SC脑区注射逆行示踪剂霍乱毒素B亚基（Cholera Toxin Bsubunit,CTB）,该病毒通过与神经节苷脂的戊多糖链结合附于细胞表面,可被轴突末端吸收并逆行运输至胞体,进而特异高效地逆行标记神经细胞。根据该示踪剂的特性,在病毒表达10天后取材并制作冰冻切片,在VTA脑区检测荧光的表达情况,确定VTA对SC的直接神经投射。采用激光共聚焦或荧光显微镜在VTA脑区观察红色荧光的表达,确定了 VTA对SC脑区的直接神经投射。综上所述,在本实验条件下,SC的Glu能神经投射特异性支配了VTA的DA能神经元,而其他两个经典的视觉初级感觉核团LGN和V1对VTA的DA能神经元无直接的神经投射;与此同时,我们首次发现了 VTA脑区对SC脑区也存在直接的神经投射,为其功能的发挥提供了物质结构基础。2、上丘（SC）对中脑腹侧被盖区（VTA）的神经投射对视觉线索诱发觅光复吸行为的调控作用本课题组前期将光遗传学技术与斯金纳操作性行为箱相结合,建立了自身给光的成瘾行为学模型。该模型具有神经核团、神经元类型及神经环路的刺激特异性,更有助于理解和阐明物质及非物质成瘾形式（如性成瘾、网络成瘾等）背后的神经调控机制。基于光遗传学技术的显著优势,在本研究中,采用了自给光模型建立成瘾行为学范式,利用光遗传学或化学遗传学技术手段特异性调控SC对VTA的神经投射通路观察其对灯光线索诱发成瘾复吸行为的影响。（1）在自给光模型中,特异性抑制上丘（SC）对中脑腹侧被盖区（VTA）的谷氨酸神经投射显著减弱灯光线索诱导的觅光复吸行为。本实验运用光遗传学技术,将含有红色荧光的光感通道蛋白病毒ChR2-mCherry注射在DAT-Cre小鼠的VTA脑区,使得光敏蛋白特异性地表达在VTA的DA能神经元,同时将含有谷氨酸特异性启动子的绿色荧光的化学遗传学抑制病毒CaMKⅡα-hM4D（Gi）-GFP注射在小鼠的双侧SC脑区,在病毒表达3周后,进行大脑灌流取材制作冰冻切片,在激光共聚焦或荧光显微镜下可观察到病毒在VTA或SC脑区的显著表达,确定该实验体系中病毒的有效性,以确保后续的神经元及神经投射的特异性操控。采用本课题组前期搭建的光遗传学技术平台,建立自给光的成瘾行为学范式。以DAT-Cre小鼠为研究对象,基于Cre-LoxP系统,将兴奋性光敏蛋白ChR2-mCherry特异性表达在VTA脑区的DA能神经元中,将刺激光纤插入小鼠大脑的单侧VTA脑区。采用固定比率1程序（fixed ratio 1,FR1）,当小鼠触有效鼻触孔1次即可通过在VTA脑区的光纤获得3s的激光刺激（20 Hz,15 ms）,与此同时有效鼻触孔内的黄色灯光开启,持续5 s,与之相反小鼠触无效鼻触孔时,则无激光刺激和灯光线索。在该程序下,训练2周,待正确鼻触次数稳定后,进行消退训练。在消退训练期,小鼠无论触有效鼻触孔还是无效鼻触孔均不能得到激光刺激,也无灯光线索的出现,在为期2周左右的训练后,小鼠的触鼻行为降低至自给光行为形成期训练后3天均值的10%以下直至稳定水平。最后,进行灯光线索诱发觅光复吸行为的测试,提前20分钟,在VTA脑区微注射0.9 ng/0.5μL/侧的氯氮平氮氧化物或0.5 μL/侧的溶剂（0.036%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO））,随后将小鼠放入训练箱中,当小鼠触有效鼻触孔可获得黄色灯光线索提示,但无激光刺激,触无效鼻触孔均无激光和鼻触灯提示。测试结果显示,给予溶剂后,点燃期与消退期的有效鼻触次数相比,存在灯光线索提示后可显著升高小鼠在有效鼻触孔的触鼻次数（采用pairsed t-tet统计分析具有显著的统计学差异,P＜0.001,t=-5.660）,提示灯光线索可诱发觅光复吸行为。但给予CNO特异性抑制了 SC对VTA的谷氨酸神经投射通路后,其与溶剂处理相比,点燃期有效鼻触次数与消退期有效鼻触次数的变化百分率较溶剂组显著降低（采用t-test统计分析具有显著的统计学差异,n=9,P=0.006,t=-3.189）,但无效鼻触无显著性变化（采用t-test统计分析无明显变化,n=9,P=0.778,t=-0.286）。以上结果提示,在自给光的成瘾行为学范式中,灯光线索点燃期特异性抑制SC-VTA的Glu能神经投射的功能,能够显著减弱线索诱发觅光复吸行为。（2）在自给光模型中,特异性激活上丘（SC）对中脑腹侧被盖区（VTA）的谷氨酸神经投射显著诱发觅光复吸行为。通过上部分实验研究我们证实了 SC-VTA的谷氨酸神经投射是线索诱发觅光复吸行为的必要条件。那么,进一步我们将研究激活SC-VTA的神经投射通路是否足以诱发觅光行为的重建,其能否成为视觉线索诱发成瘾复吸行为的充分条件。根据联合学习记忆的理论,我们认为灯光刺激与成瘾的奖赏性刺激经过联合学习后,灯光被赋予奖赏激励价值成为成瘾相关线索,在此过程中SC-VTA的神经投射的神经可塑性变化可能是其结构基础,因此在消退后,灯光线索再次出现能够快速特异性地激活SC-VTA神经投射通路,诱发强烈渴求,导致复吸行为的出现。与之相反,灯光和成瘾性奖赏刺激未经联合学习过程,那么激活天然存在SC-VTA神投射通路将不能诱发成瘾复吸行为的出现。为了阐明这一科学问题,我们在自给光的模型中设立鼻触灯光刺激匹配组、鼻触灯光刺激不匹配组以及无鼻触灯光刺激组,在经过消退训练后,特异性激活SC-VTA的谷氨酸神经通路,以此证实该神经投射通路很可能是视觉线索诱发成瘾复吸的充分条件。本实验运用光遗传学技术,将含有红色荧光的光敏感通道蛋白病毒ChR2-mCherry注射在DAT-Cre小鼠的VTA脑区,使得光敏蛋白特异性地表达在VTA的DA能神经元,同时将带有谷氨酸启动子的绿色荧光的化学遗传学激活病毒CaMKⅡα-hM3D（Gq）-GFP注射在小鼠的单侧SC脑区,病毒表达3周后,进行大脑灌流取材制作冰冻切片,在激光共聚焦或荧光显微镜下可观察到病毒在VTA或SC脑区的显著表达,确定该实验体系中病毒的有效性,确保后续的神经元及神经投射的特异性调控。同样采用上述自给光模型建立的成瘾行为学范式训练小鼠,将含有红色荧光的光敏感通道蛋白ChR2-mCherry特异性表达在VTA的DA能神经元上,将激光刺激光纤埋置VTA脑区。采用FR1程序,当小鼠触有效鼻触孔1次即可通过在VTA脑区的光纤获得3 s的激光刺激（20 Hz,15 ms）。在此训练过程中,我们将小鼠随机分为灯光刺激匹配组（Paired Conditioned Stimulation Group,CS组）、灯光刺激不匹配组（Unpaired Conditioned Stimulus Group,US组）和无触鼻灯光刺激组,即对照组（Control Group,Con组）。CS组的小鼠,当触到有效鼻触孔时,同时获得激光刺激和鼻触孔内的灯光提示,灯亮的时间为5 s;US组小鼠即当小鼠触有效鼻触孔时,只可获得激光刺激,并无伴随的鼻触灯亮,但正确鼻触孔内的灯会按照每60-90 s的时间间隔自动开启,而在无鼻触灯的空白对照组（Con组）,小鼠自给光训练的全过程均无鼻触灯的提示。根据以上程序的设置和分组安排,进行大约2周的训练,待正确鼻触次数稳定后,进行消退训练。在消退训练期,小鼠无论触有效鼻触孔还是无效鼻触孔均不能得到激光刺激,同时无灯光线索的出现,在为期2周左右的消退训练后,小鼠的触鼻行为显著降低至稳定水平。最后进行点燃期测试,提前20分钟,在VTA脑区微注射0.9 ng/0.5μL/侧的CNO溶液或0.5 μL/侧的溶剂0.036%DMSO溶液,随后将小鼠放入训练箱中,此时小鼠无论触有效鼻触孔还是无效鼻触孔均无激光刺激和灯光提示。结果显示:①在灯光刺激匹配组（CS组）,VTA脑区微注射CNO后可特异性激活SC-VTA的Glu能神经投射,激活该神经投射可显著增加小鼠有效鼻触次数(点燃期与消退期最后3天平均值的有效鼻触次数相比,具有统计学差异,因为正态性检验P＜0.050,故采用Wilcoxon Signed Rank Test检验分析（P＜0.001,W=66.000,T+=66.000,T-=-0.000）;但给予溶剂处理后,有效鼻触次数与消退期最后3天平均值的相比无显著性差异（paired t-test统计分析,P＞0.05,t=0.0229）;但溶剂或CNO处理均不改变无效鼻触次数（点燃期无效鼻触与消退期最后3天无效鼻触鼠次数平均值相比无显著的统计学差异,pairedt-test统计分析,P＞0.05）。②灯光刺激非匹配组（US组）,首先在US组中,点燃期提前20 min在VTA脑区微注射CNO后特异性激活SC-VTA的Glu能神经投射,然后放入操作箱中,小鼠的有效鼻触次数显著升高（与消退期最后3天的有效鼻触次数均值进行paired t-test统计分析P＜0.05,t=-2.559）,但给予溶剂后无显著变化（与消退期最后3天的有效鼻触次数均值相比,pairedt-test统计检验分析P＞0.05,t=-0.365）。溶剂或CNO处理均不改变小鼠无效鼻触的次数（点燃期与消退期最后3天的无效鼻触次数均值相比较,进行统计分析,CNO处理,P＞0.05,W=8.000,T+=18.000,T-=-10.00,Wilcoxon Siegnd Singned Rank Test;溶剂处理,P＞0.05,t=-1.649,paired t-test）。③在训练全程无鼻触灯亮的Con组中,点燃期提前20 min在VTA脑区微注射CNO,特异性激活SC-VTA的Glu能神经投射,然后放入操作箱中,小鼠触有效鼻触孔或无效鼻触孔的触鼻次数均无显著升高（与消退期最后3天的有效鼻触或无效鼻触次数平均值进行paired t-test统计分析,有效鼻触次数P＞0.05,t=0.870;无效鼻触次数,P＞0.05,t=-0.129）,并且溶剂处理也不改变小鼠的有效鼻触或无效鼻触次数（与消退期最后3天的有效鼻触或无效鼻触次数进行均值pairedt-test统计分析,有效鼻触次数,P＞0.05,t=1.507;无效鼻触次数,P＞0.05,t=1.083）。通过以上结果发现,灯光刺激匹配组（CS组）,特异性激活SC-VTA的Glu能神经投射通路可显著诱发觅光行为的重建,这与我们的之前的假设相一致。但在灯光刺激不匹配组（US组）,特异性激活SC-VTA的神经投射通路也可诱发觅光行为的重建;而在自给光训练中完全没有鼻触灯的Con组中,特异性激活SC-VTA的神经投射通路则无法诱导小鼠的觅光行为的重建。那么在产生这一结果的主要原因可能是,在US组中,虽然鼻触灯光与激光刺激VTA产生的奖赏性刺激没有实现条件性配对,但是在自给光的训练周期中,鼻触灯仍在一定时间内出现,而在结束训练后,在饲养环境中是并无此类灯光的出现,因此该触鼻灯的提示仍很大程度上成为自给光行为中的特异性背景线索,虽然不同于线索匹配组中的条件性刺激,但在成瘾行为中无论是背景线索还是条件性线索均是能够被赋予奖赏激励价值从而诱发成瘾复吸行为出现的,所以在US组中,灯光和奖赏性刺激仍存在联合学习的过程,因此,该过程中SC-VTA的神经投射也发生了特异性的改变,从而能够激发复吸行为的出现。而对于从而出现灯光的Con组而言,因为没有经过联合学习的过程,所以激活未发生改变的SC-VTA的Glu能神经投射,则不能诱发觅光复吸行为的出现。那么这一结果,也恰恰证实了我们的推测,在成瘾的过程中,经过联合学习的过程,发生特异性改变的SC-VTA的Glu能神经投射是介导灯光视觉线索诱发成瘾复吸的重要神经调控机制。结论本研究围绕本课题组前期提出的“VTA-DA神经系统介导的强烈心理渴求可直接介导线索诱发成瘾复吸行为”这一科学工作假说。以灯光线索为切入点,深入揭示了在成瘾行为中,线索激活VTA脑区的特异性神经调控通路机制。研究发现,采用自给光建立的成瘾性行为学范式模型,灯光和奖赏性刺激经过联合学习的匹配过程,SC-VTA之间的神经投射可能发生特异性改变,成为直接介导灯光线索诱发成瘾复吸的特异性神经调控通路,而未经联合学习匹配训练的对照组,天然的SC-VTA神经投射通路的激活则无法诱导觅光复吸行为的出现。该结果不仅为视觉线索诱发成瘾复吸找到了特异性的神经调控通路,同时也为“初级感觉核团可通过激活皮层下深部核团VTA直接诱发复吸行为,而不受高级认知皮层中枢的控制”这一科学假想提供了实验依据。该研究就为解决线索诱发成瘾复吸提供了新视角,对全面阐明药物成瘾神经生物学机制具有重要意义。