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目的本研究在建立人体肥胖网膜脂肪组织研究队列、构建高脂饮食诱导肥胖大鼠模型以及体外培养脂肪细胞的基础上,观察高水平FFA对脂肪细胞TLR9/KLF4及NF-κB炎症信号通路关键因子表达的影响,探讨TLR9/KLF4在FFA诱发的脂肪细胞炎症反应过程中的作用及可能的机制。方法选取受试个体正常组（Normal Control,NC）50例、肥胖组（Obese,OB）45例,检测一般资料和生化指标。Wistar健康雄性大鼠32只,分别正常饮食和高脂饮食喂养,诱导肥胖模型。高脂饮食喂养至第4、10周检测大鼠血脂、血糖水平。在体外培养3T3-L1前脂肪细胞,诱导分化为成熟的脂肪细胞后用油红O染色鉴定。不同浓度棕榈酸PA（0μM、0.2μM、2μM、20μM、100μM、200μM）刺激脂肪细胞,同时运用si-RNA技术下调TLR9/KLF4、p IRES2-KLF4-Zs Green1上调KLF4、慢病毒感染脂肪细胞上调TLR9。q RT-PCR和Western Blot技术检测动物、人体网膜脂肪组织及脂肪细胞中TLR9、KLF4及NF-κB炎症信号通路关键因子m RNA和蛋白表达水平,Elisa法检测血浆及上清液中炎症因子释放水平。BSP技术检测肥胖个体网膜脂肪组织KLF4基因DNA甲基化情况。结果1.人体组织实验（1）受试个体一般资料、血脂及血浆炎症因子水平比较OB组体质量、WC、HC、WHR、BMI、TG、LDL和TNF-α水平显著高于NC组,而APN水平显著低于NC组,差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）受试个体网膜脂肪组织关键因子m RNA及蛋白表达水平OB组TLR9和KLF4 m RNA及蛋白表达水平显著低于NC组（P<0.05）,APN m RNA及蛋白表达水平低于NC组。OB组P65（NF-κB活性亚单位）、TNF-α和IL-6 m RNA及蛋白表达水平显著高于NC组（P<0.05）。（3）TLR9/KLF4表达与血脂水平及炎症信号通路关键因子表达相关性分析TLR9 m RNA表达水平与HDL、MYD88、SRC和KLF4显著正相关（P<0.05）;KLF4m RNA表达水平与BMI、TG和TNF-α显著负相关（P<0.05）,而与NF-κB显著正相关（P<0.05）。（4）正常和肥胖个体网膜脂肪组织DNA甲基转移酶（DNA Methyltranseferase,DNMTs）表达及KLF4基因甲基化阳性率比较OB组（n=45）DNMT1、DNMT3a和DNMT3b m RNA表达水平显著高于NC组（n=50）（P<0.05）。OB组KLF4基因启动子区甲基化阳性率（n=20,10.429%）显著高于正常个体（n=20,5.714%）（P<0.01）。OB组KLF4基因启动子区Cp G33和Cp G34位点甲基化阳性率显著高于NC组（P<0.01）。2.动物实验（1）成功构建肥胖大鼠模型高脂饮食喂养至第4周,实验组大鼠体重开始显著高于对照组（P<0.05）。高脂饮食喂养至第10周实验组大鼠体重进入平台期,但仍显著高于对照组（P<0.01）。此时,实验组大鼠体重（403.00±50.38）g已经超过对照组大鼠（318.50±38.07）g的20%;且实验组大鼠Lee’s指数（337.10±4.72）显著高于对照组大鼠（323.42±4.72）（P<0.01）。实验组大鼠腰围显著高于正常组大鼠（19.88±0.48 vs 17.58±0.30,P<0.01）。实验组大鼠网膜脂肪组织含量多于正常组大鼠,并且伴有脂肪肝的形成。（2）两组大鼠血糖、血脂、脂肪细胞因子及炎症因子水平比较高脂饮食喂养至第4周,实验组大鼠FFA、TG、TC和LDL水平显著高于对照组（P<0.05）;高脂饮食喂养至第10周,实验组大鼠Glu、TG、FFA和炎症因子TNF-α水平显著高于对照组,而抗炎因子LPT和APN水平显著低于对照组（P<0.05）。（3）网膜脂肪组织炎症信号通路关键因子m RNA表达差异实验组大鼠网膜脂肪组织TLR9、MYD88、KLF4和NF-κB m RNA表达水平低于对照组;SRC和IL-6 m RNA表达水平高于对照组。（4）网膜脂肪组织炎症信号通路关键因子相关性分析血浆FFA水平与TLR9 m RNA表达水平负相关,与TNF-α水平显著正相关（P<0.05）;KLF4与TLR9 m RNA表达水平显著正相关（P<0.05）。3.体外细胞实验（1）3T3-L1脂肪细胞的培养及分化未诱导分化的3T3-L1细胞呈梭形,胞浆中无脂滴;诱导分化至第8天,90%以上细胞均分化成熟,有较多的脂滴聚集。油红O染色结果显示,脂肪细胞中的脂滴染成红色,成功诱导3T3-L1细胞分化为脂肪细胞。（2）检测KLF4对下游炎症因子的调控作用下调KLF4后,炎症因子IL-6和MCP-1的m RNA表达水平显著增加（P<0.01）,MCP-1释放水平显著增加（P<0.01）,而抗炎因子APN的m RNA表达水平显著降低（P<0.05）。上调KLF4后,炎症相关因子P65、TNF-α和IL-1β的m RNA表达水平显著降低（P<0.05）,MCP-1释放水平显著降低（P<0.05）,而抗炎因子APN的m RNA表达水平显著增加（P<0.05）。（3）检测TLR9对KLF4调控作用上调TLR9后,KLF4 m RNA和蛋白表达水平均显著高于Mock和Negative Control组（P<0.05）,并且P65和MCP-1 m RNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）,APN m RNA表达水平显著高于对照组（P<0.01）。下调TLR9后,KLF4 m RNA和蛋白表达水平显著低于Mock和Negative Control组（P<0.05）,并且P65、IL-6和MCP-1 m RNA表达水平显著高于对照组（P<0.05）,APN m RNA表达水平显著低于对照组（P<0.01）。（4）不同浓度PA刺激脂肪细胞,检测下游炎症相关因子表达水平随着PA浓度的增加,TLR9蛋白表达水平无显著差异,而KLF4 m RNA及蛋白表达水平呈现先增加后降低的趋势,其中PA浓度为20μM时,KLF4表达水平最高,与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。100μM及200μM PA刺激后KLF4 m RNA和蛋白表达水平与20μM相比均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。20μM PA刺激组IL-6、MCP-1和APN m RNA表达水平以及IL-6释放水平显著高于0μM组;200μM PA刺激组P65、IL-6、MCP-1和IL-1βm RNA表达水平以及IL-6和MCP-1释放水平显著高于0μM组;200μM PA刺激组IL-6 m RNA表达水平以及IL-6和MCP-1释放水平显著高于20μM组,而APN m RNA表达水平显著低于20μM组,以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。（5）20μM PA刺激脂肪细胞同时下调KLF4,检测下游炎症相关因子表达水平下调KLF4组炎症因子MCP-1和IL-1βm RNA表达水平显著高于对照组（P<0.05）,IL-6释放水平显著高于对照组（P<0.01）;而抗炎因子APN m RNA表达水平显著低于对照组（P<0.01）。（6）200μM PA刺激脂肪细胞同时上调KLF4,检测下游炎症相关因子表达水平上调KLF4组P65、TNF-α和IL-1βm RNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）,而APN m RNA表达水平显著高于对照组（P<0.05）。（7）检测KLF4对脂肪细胞糖脂代谢能力的影响上调KLF4后,上清中甘油三酯和葡萄糖含量显著低于对照组（P<0.05）,下调KLF4后,上清中甘油三酯含量显著高于对照组（P<0.05）。20μM PA刺激同时下调KLF4后,上清中甘油三酯和葡萄糖含量显著高于对照组（P<0.05）。结论（1）在脂肪细胞中,TLR9通过上调KLF4,抑制NF-KB活性亚单位P65表达,发挥抗炎作用;（2）低浓度PA上调KLF4表达,促进脂肪细胞糖脂代谢能力,发挥抗炎作用;高浓度PA抑制KLF4表达,抗炎作用减弱,加剧炎症;（3）肥胖个体网膜脂肪组织KLF4低表达可能与KLF4基因启动子区高甲基化水平有关。