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目的:探讨结直肠癌肝转移患者血清外泌体中环状RNA(circRNA)的表达差异，并分析其早期诊断结直肠癌肝转移的诊断效能;结合前期实验结果及生物信息学分析，预测差异表达的circRNA参与的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，利用临床组织样本及细胞功能实验对预测的竞争性内源性RNA(ceRNA)网络进行初步验证。
方法:(1)使用基因芯片技术，分析结直肠癌肝转移患者血清外泌体中circRNA差异表达谱，结合前期实验结果，利用circRNA-miRNA互作预测数据库，筛选出进一步研究的circRNA;利用miRNA靶基因预测数据库，并对靶基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，筛选出进一步研究的靶基因，并初步构建结直肠癌肝转移中的circRNA-miRNA-mRNA互作网络。
(2)通过比较41例结直肠癌原发患者与44例结直肠癌肝转移患者临床血清样本，验证筛选出的circRNA表达情况与芯片结果趋势是否一致，采用ROC曲线评估其诊断价值;利用30例结直肠癌原发灶组织与14例肝转移灶组织，检测其circRNA、miRNA、mRNA的表达情况及相关趋势。
(3)双荧光素酶报告基因实验验证构建的circRNA-miRNA-mRNA互作网络是否存在结合;对包括正常肠上皮细胞在内的5种结直肠癌细胞系进行筛选，利用瞬时转染，使细胞中的miRNA表达增强或抑制，利用qRT-PCR、Western Blot检测转染后细胞中circRNA、mRNA的表达情况，分析二者与miRNA变化间关系;通过CCK8、划痕实验、Transwell侵袭实验，分析miRNA对结直肠癌细胞功能的影响。
结果:(1)本研究中共检测到7048个差异表达的circRNA，其中在结直肠癌肝转移患者中上调的有3752个，下调的有3296个;对数据库预测出的靶基因的GO分析和KEGG通路分析显示，主要集中在磷脂酰肌醇介导的信号传导（phosphatidylinositol-mediated signaling）、染色质沉默复合物(chromatin silencing complex)、Wnt信号通路，钙调节通路(Wnt signaling pathway,calcium modulating pathway)以及肿瘤通路(Pathways in cancer)等与肿瘤相关的条目中;综合前期实验结果、芯片分析数据以及生物信息学分析，初步构建了hsa_circ_0080091——miR-99b-5p——FGFR3的互作网络。
(2)与结直肠癌原发患者相比，发现结直肠癌肝转移患者血清外泌体中的hsa_circ_0080091表达明显上调(P＜0.05)，与基因芯片结果趋势一致，ROC曲线下面积AUC为0.664，联合CEA、CA19-9指标有较好诊断价值;与结直肠癌原发灶组织比较，肝转移灶组织中miR-99b-5p表达下调，hsa_circ_0080091表达上调、FGFR3表达上调(P＜0.001)，二者与miR-99b-5p表达水平均呈负相关关系。
(3)双荧光素酶报告基因实验发现，野生型质粒载体与miRNA-99b-5p mimic、miRNA-99b-5p mimic NC共转染后，荧光值减低(P＜0.001)，突变型质粒载体与miRNA-99b-5p mimic、miRNA-99b-5p mimic NC共转染后，荧光值无明显差异(P＞0.05)。qRT-PCR、WestemBlot实验表明，与对照组相比，干扰miR-99b-5p表达后，hsa_circ_0080091表达上调(P＜0.01)，FGFR3表达上调(P＜0.001)，在蛋白水平表达上调(P＜0.01);增强miR-99b-5p后，hsa_circ_0080091表达下调(P＜0.01)，FGFR3表达下调(P＜0.001)，在蛋白水平表达下调(P＜0.01);CCK8结果显示干扰miR-99b-5p表达后，细胞增殖能力加强(P＜0.001);过表达miR-99b-5p后，细胞增殖能力减弱(P＜0.001);划痕实验采用愈合率评价转染后细胞迁移能力显示，干扰miR-99b-5p表达后，细胞迁移能力加强(P＜0.01);增强miR-99b-5p后，细胞迁移能力减弱(P＜0.05);Transwell分析细胞迁移能力结果表明，干扰miR-99b-5p表达后，细胞侵袭能力加强(P＜0.05);增强miR-99b-5p后，细胞增殖能力减弱(P＜0.001)。
结论:(1)结直肠癌肝转移患者血清外泌体中hsa_circ_0080091表达上调，具有诊断效能，联合CEA、CA19-9诊断效能更高;(2)结直肠癌原发灶与肝转移灶中hsa_circ_0080091与FGFR3的表达水平与miR-99b-5p呈现负相关关系;(3)双荧光素酶报告基因实验证实has_circ_0080091可以靶向结合miRNA-99b-5p;miR-99b-5p表达变化能够影响has_circ_0080091、FGFR3的表达水平;(4)干扰或增强细胞中miR-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力;初步验证hsa_circ_0080091——miR-99b-5p——FGFR3在结直肠癌中具有调控作用。
方法:(1)使用基因芯片技术，分析结直肠癌肝转移患者血清外泌体中circRNA差异表达谱，结合前期实验结果，利用circRNA-miRNA互作预测数据库，筛选出进一步研究的circRNA;利用miRNA靶基因预测数据库，并对靶基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，筛选出进一步研究的靶基因，并初步构建结直肠癌肝转移中的circRNA-miRNA-mRNA互作网络。
(2)通过比较41例结直肠癌原发患者与44例结直肠癌肝转移患者临床血清样本，验证筛选出的circRNA表达情况与芯片结果趋势是否一致，采用ROC曲线评估其诊断价值;利用30例结直肠癌原发灶组织与14例肝转移灶组织，检测其circRNA、miRNA、mRNA的表达情况及相关趋势。
(3)双荧光素酶报告基因实验验证构建的circRNA-miRNA-mRNA互作网络是否存在结合;对包括正常肠上皮细胞在内的5种结直肠癌细胞系进行筛选，利用瞬时转染，使细胞中的miRNA表达增强或抑制，利用qRT-PCR、Western Blot检测转染后细胞中circRNA、mRNA的表达情况，分析二者与miRNA变化间关系;通过CCK8、划痕实验、Transwell侵袭实验，分析miRNA对结直肠癌细胞功能的影响。
结果:(1)本研究中共检测到7048个差异表达的circRNA，其中在结直肠癌肝转移患者中上调的有3752个，下调的有3296个;对数据库预测出的靶基因的GO分析和KEGG通路分析显示，主要集中在磷脂酰肌醇介导的信号传导（phosphatidylinositol-mediated signaling）、染色质沉默复合物(chromatin silencing complex)、Wnt信号通路，钙调节通路(Wnt signaling pathway,calcium modulating pathway)以及肿瘤通路(Pathways in cancer)等与肿瘤相关的条目中;综合前期实验结果、芯片分析数据以及生物信息学分析，初步构建了hsa_circ_0080091——miR-99b-5p——FGFR3的互作网络。
(2)与结直肠癌原发患者相比，发现结直肠癌肝转移患者血清外泌体中的hsa_circ_0080091表达明显上调(P＜0.05)，与基因芯片结果趋势一致，ROC曲线下面积AUC为0.664，联合CEA、CA19-9指标有较好诊断价值;与结直肠癌原发灶组织比较，肝转移灶组织中miR-99b-5p表达下调，hsa_circ_0080091表达上调、FGFR3表达上调(P＜0.001)，二者与miR-99b-5p表达水平均呈负相关关系。
(3)双荧光素酶报告基因实验发现，野生型质粒载体与miRNA-99b-5p mimic、miRNA-99b-5p mimic NC共转染后，荧光值减低(P＜0.001)，突变型质粒载体与miRNA-99b-5p mimic、miRNA-99b-5p mimic NC共转染后，荧光值无明显差异(P＞0.05)。qRT-PCR、WestemBlot实验表明，与对照组相比，干扰miR-99b-5p表达后，hsa_circ_0080091表达上调(P＜0.01)，FGFR3表达上调(P＜0.001)，在蛋白水平表达上调(P＜0.01);增强miR-99b-5p后，hsa_circ_0080091表达下调(P＜0.01)，FGFR3表达下调(P＜0.001)，在蛋白水平表达下调(P＜0.01);CCK8结果显示干扰miR-99b-5p表达后，细胞增殖能力加强(P＜0.001);过表达miR-99b-5p后，细胞增殖能力减弱(P＜0.001);划痕实验采用愈合率评价转染后细胞迁移能力显示，干扰miR-99b-5p表达后，细胞迁移能力加强(P＜0.01);增强miR-99b-5p后，细胞迁移能力减弱(P＜0.05);Transwell分析细胞迁移能力结果表明，干扰miR-99b-5p表达后，细胞侵袭能力加强(P＜0.05);增强miR-99b-5p后，细胞增殖能力减弱(P＜0.001)。
结论:(1)结直肠癌肝转移患者血清外泌体中hsa_circ_0080091表达上调，具有诊断效能，联合CEA、CA19-9诊断效能更高;(2)结直肠癌原发灶与肝转移灶中hsa_circ_0080091与FGFR3的表达水平与miR-99b-5p呈现负相关关系;(3)双荧光素酶报告基因实验证实has_circ_0080091可以靶向结合miRNA-99b-5p;miR-99b-5p表达变化能够影响has_circ_0080091、FGFR3的表达水平;(4)干扰或增强细胞中miR-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力;初步验证hsa_circ_0080091——miR-99b-5p——FGFR3在结直肠癌中具有调控作用。