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三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根,是著名的传统中药,具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效。近年来用于治疗冠心病、糖尿病、抗心绞痛、抗血栓等。三七由于含有与同属植物人参(Panax ginseng C.A.Meycr)相似的达玛烷型三萜皂苷类成分,加之其总皂苷在耐缺氧、抗衰老、提高机体免疫力等方面的药理作用显著优于人参总皂苷,因而引起国内外药学家的广泛重视。本课题应用现代天然药物化学技术及免疫学方法,以免疫佐剂活性评价为导向,对三七总皂苷中的免疫佐剂活性成分进行筛选,分离得到7个具有免疫活性的皂苷,并采用化学方法和包括ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC及HMBC谱等多种光谱技术确定化学结构,其中三七皂苷U为新化合物,人参皂苷Rh4为首次从三七中分离得到。 1.提取与分离 三七干燥块根用70%乙醇回流提取,乙醇提取物依次用乙醚、水饱和正丁醇萃取后,经大孔吸附树脂得精制三七总皂苷。三七总皂苷经硅胶柱色谱、Rp-18柱色谱及半制备HPLC分离、纯化,得到7个皂苷化合物。 2.结构测定 通过化学方法和ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HMBC及HMQC等光谱技术分析测定,化台物Ⅰ~Ⅶ的结构分别被确定为20(s)-原人参三醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、20(s)-原人参三醇-Δ20(22),24(25)-二烯-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(人参皂苷-Rh4)、20(s)-原人参三醇-6-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(三七皂苷-R1)、20(s)-原人参三醇-6-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(人参皂苷-Re)、20(s)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(三七皂苷-K)、20(s)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-20-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(人参皂苷-Rb1)和20(s)-原人参三醇-6-O-β-D-吡喃葡萄糖-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(人参皂苷-Rg1)。其中化合物Ⅰ为新化合物,并命名为三七皂苷-U;人参皂苷-Rh4,系首次从植物三七中分离得到。 3.溶血性试验 采用比色法测定7个皂苷化合物引起兔红细胞50%溶血浓度(HD50值),结果表明:7个化合物的HD50值均大于300μg/ml,溶血性均显著小于Quil A(P<0.001),后者的HD50值为19.8±0.57μg/ml。七种皂苷中以三七皂苷K的溶血性最大,人参皂苷Re的溶血性最小。渤江人学/Nj关放之三古澎宕另户公夕夕全疫岌芳夕片于理戒分云沙乡万4.体外对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响 QuilA、人参皂普Rbl、Rh4和三七皂昔U(0.01一10.0林留扣1),人参皂普Rg!、Re、三七皂普K、RI(0 .1一10.0林留ml)体外均能显著或极显著促进ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖反应护<0.05,p<0.01或尸<0.001)。人参皂普Rb,和三七皂普U(0.01一10.0林g/ml),Qui1A(0.01、0.1林留nll)、人参皂普Rll月(1.0、10.0协g/ml)、Rg;、Re(0.1一10.0林留ml)、三七皂普K(0.01一1.0雌/ml)、R、(0 .1、1.0林留ml)体外对LPS诱导小鼠B淋巴细胞增殖反应亦均有显著或极显著促进作用(P<0.05,尸<0.01或尸<0.001)。5.对OVA受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响 QuilA、人参皂普Rg,、Re(10,25林g),人参皂普Rbl和三七皂普Rl(25,50林g),三七皂营K(25林g)体内均能显著或极显著促进conA诱导的ovA受免小鼠T淋巴细胞增殖反应伊<0.05,P<0.ol或尸<0.001)。Al(OH):和人参皂普R场对conA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖反应作用不显著。人参皂营Rbl、Rh4和三七皂营K(10,25,50林g),Qtu1A、人参皂营Re(一。,25林g),三七皂普RI(25,50协g),人参皂昔Rg;(25林g)体内对LpS诱导的oVA受免小鼠B淋巴细胞增殖反应亦均有显著或极显著促进作用(P<0.05,P<0.ol或P<0.ool)。ovA诱导的小鼠B淋巴细胞增殖反应也可被QuilA、人参皂普Rb,和三七皂普K、R.(10,25,50雌),人参皂着Re(10,25卜g),人参皂昔Rgl(25,50协g),人参皂普R五4(25协g)显著或极显著增强 仁P<0 .05,P<0.01或P<0.001)。6.对OVA受免小鼠血清中特异性抗体效价的影响 QuilA、人参皂普Rb】、Rgl、Re(10,25,50林g),三七皂普K、R一(10,25协g),人参皂营Rll4(25陀)均能显著或极显著提高ovA受免小鼠血清中OVA特异性lgG抗体效价(P<0 .05,尸<。.01或P<0.001)。人参皂昔Rb一、Rg:、Re和三七皂普K(10,25,50林g),QuilA(10,25林g),三七皂普R,(25,50协g),人参皂普Rh4(25林g)均能显著或极显著提高OVA受免小鼠血清中o认特异性IgGI抗体效价护<0.05,P<O.ol或P<o.ool)。以QllilA、人参皂普Rb,、Re(10,25,50卜g),三七皂普R!(10,25林g),人参皂营Rgl(25,50林g),人参皂昔Rh4和三七皂普K(25雌)为佐剂免疫组小鼠血清中oVA特异性IgGZb抗体效价显著或极显著高于单独ovA 免疫对照组(p<0.05,P<o.01或六0.001)。 综上所述,人参皂昔Rbl、Rgl、R。、Rh4和三七皂普K、RI不仅溶血性较小,而且 均可显著或极显著增强OVA受免小鼠的细胞免疫和体液免疫应答反应。这在一定程度上也 进一?