随着化石燃料的大量消耗,从木质纤维素中生产生物燃料受到人们广泛关注。然而在以木质纤维素为原料进行工业化规模生物炼制时,最大的障碍是木质纤维素降解酶成本过高。丝状真菌具有较强的分泌木质纤维素酶能力,一直是人们研究的热点。通常认为提高纤维素酶基因表达量是提高丝状真菌分泌纤维素酶能力的重要方式,所以大量研究集中在纤维素酶转录水平的研究。与转录水平相比,纤维素酶分泌路径研究相对较少,但不可否认这方面也非常重要。很有必要加强丝状真菌分泌路径研究,对于构建高效分泌纤维素酶的菌株具有重要的意义。基于此研究现状,本论文开展两方面工作：第一方面利用纤维素酶转录水平现有成果,对纤维素酶高产菌株进行遗传改造；第二方面针对位于丝状真菌分泌路径上p24蛋白进行生理功能研究。1草酸青霉JUA10-1胞外木质纤维素降解酶系的理性改造通过同源比对确定草酸青霉中纤维素酶转录抑制因子有creA和acel。利用凝胶阻滞迁移实验证明草酸青霉CreA结合结构域能和cel7a启动子-216----446区发生结合,Acel结合结构域和cel7a启动子-446----643区发生结合。采用转录抑制因子creA和acel的结合结构域加上转录激活因子xlnR的效应结构域组成人工激活元件,导入到草酸青霉JUA10-1中,构建成功草酸青霉纤维素酶高产菌株CXA。在流加葡萄糖的合成培养基中,FPase、pNPCase、pNPGase和胞外蛋白分泌量分别是出发株的1.14,1.12,1.64和1.39倍,同时主要纤维素酶,半纤维素酶基因在转录水平都有明显提高。在流加生物质水解液的工业化廉价培养基培养时,草酸青霉pNPCase, pNPGase和CMCase是出发菌株的1.32,1.56和1.10倍,同时在转录水平上验证主要纤维素酶基因表达量也提高。这说明构建的纤维素酶高产菌株草酸青霉CXA具有很好的工业应用前景。2草酸青霉和里氏木霉p24同源蛋白Erp生理功能比较p24蛋白家族是位于真核细胞内膜系统上小分子的跨膜蛋白。在酵母和果蝇中,其主要作用为参与物质选择性运输及质量控制。本论文首次在丝状真菌中对p24y家族同源蛋白Erp进行生理功能研究并发现了一种新的纤维素酶转录激活机制。通过序列比对发现草酸青霉pErp和里氏木霉tErp蛋白氨基酸序列相似性达75%以上,但是Erp在两株菌株中参与的生理路径明显不同。形态发生方面：里氏木霉tErp参与分生孢子生成,细胞膜完整性维持及菌丝极性形成；草酸青霉pErp参与维持细胞膜完整性及菌丝侧枝成熟。蛋白分泌方面,敲除erp基因后两株菌内部都会造成分泌压力,但两种菌株转录水平响应机制明显不同：里氏木霉下调相应基因表达；草酸青霉上调相应基因表达。3草酸青霉p24异二聚体生理功能研究以酵母p24蛋白为模板,通过双向同源序列比对确定草酸青霉中含有4个p24蛋白家族成员,分别属于四个不同亚家族。通过胞内蛋白SDS-PAGE推测,这四个亚家族成员最可能存在形式是以两两形成不同的异二聚体。并对其中Erp和Pδ进行研究。利用荧光双分子互补实验证明Erp和Pδ在草酸青霉体内形成异二聚体。这个p24蛋白复合体参与到许多重要的形态发生事件,例如孢子生成,菌丝生长和侧枝发育。定量蛋白质组研究显示敲除erp和pδ的菌株体内存在分泌压力,暗示着这个p24蛋白复合体可能参与到货物运输。同时菌株为了存活启动相应机制来缓解分泌压力,上调了参与清除累积在胞内分泌蛋白的蛋白,下调了DNA复制和生物合成相关蛋白。p24也可能参与到小泡生成。酵母中敲除所有p24同源蛋白对货物运输和生长造成的影响较小,但是草酸青霉ΔpErppδ菌株却在货物运输和形态发生方面表现出明显的差异。这也反映了p24蛋白在不同物种之间功能上存在多样性。