论文部分内容阅读
感染性脑损伤是儿科常见的危急重症,虽然随着高效抗生素的广泛应用,近年死亡率有所下降,但其致残率仍然很高,存活的患儿中约有30%-50%留有严重的神经系统后遗症。感染性脑损伤时血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)通透性增高所致的颅高压是其患者致死或致残的主要原因之一。脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)及BMECs(?)司的紧密连接(tight junction,TJ)是维持BBB结构和功能完整的主要成分及结构基础。已有的研究发现多种因素参与了感染性脑损伤时BBB通透性增高的发生发展,涉及细菌毒素如脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、细胞因子如肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-α, TNF-α)与BMECs的相互作用。目前对TJ的研究主要以肺微血管内皮细胞或上皮细胞为对象,感染性脑损伤时LPS致BMECs通透性增高、BMECs-TJ改变及其调控机制的研究较少。小分子G蛋白Rho (Ras homologous, Rho)属于Ras超家族,包括Rho (RhoA、RhoB、RhoC)、Rac和Cdc42三个亚家族,在细胞骨架的相关活动如细胞迁移、轴突导向、细胞变形、收缩粘附等过程中发挥重要的作用。其中,RhoA、Rac1和Cdc42是研究最为深入的成员。RhoA通过其上游的鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)与G蛋白耦联受体(GPCRs)密切联系；RhoA下游的Rho激酶激活后可取代肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)直接磷酸化肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC),提高肌球蛋白活性,使肌动-肌球蛋白交联增加,导致细胞收缩,细胞间隙扩大。本课题组的前期研究发现,应用Rho激酶特异性抑制剂Y-27632可以部分抑制LPS诱导的体外BBB通透性增高,提示LPS可能通过RhoA信号途径影响BBB通透性。因此,研究LPS及TNF-a对BMECs的影响并探讨其具体的调控机制,有助于了解感染性脑损伤时BBB通透性增高的病理过程,为其临床防治提供新的思路。本研究分为三部分：第一部分LPS对原代大鼠BMECs通透性的影响及机制目的：探讨LPS对大鼠BMECs通透性的影响及其可能的机制。方法：分离和培养原代大鼠BMECs,随机分为对照组和LPS干预组。利用跨内皮细胞电阻抗(transendothelial electrical resistance, TEER)检测(?)BMECs通透性,pull-down法测定RhoA活性,Western blot检测(?)p115RhoGEF和TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达变化。结果：与对照组(159.0±8.6Ω·cm2)比较,LPS作用3h时大鼠BMECs的TEER值明显下降(108.3±4.21Ω·cm2),作用12h时LPS干预组TEER达最低水平(85.4±2.52Ω·cm2)。Pull-down法证实LPS作用5min后RhoA活性增高,15min达到高峰；Western blot证实LPS作用1h后p115RhoGEF蛋白表达上调,3h达到高峰,12h降至正常水平；LPS作用3h后TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表达均有不同程度下降。结论：LPS导致BMECs通透性增高,其机制与TJ蛋白表达水平下降有关。p115RhoGEF/RhoA信号通路的活化可能与此过程有关。第二部分p115RhoGEF/RhoA信号通路参与LPS致BMECs通透性增高的调控目的：探讨p115RhoGEF/RhoA信号途径参与LPS致BMECs通透性增高的调控机制。方法：(1)体外培养小鼠BMECs株(bEnd.3细胞),Western blot检测LPS刺激后不同时间点p115RhoGEF的表达水平；(2)合成P115RhoGEF小干扰RNA (siRNA)并转染bEnd.3细胞,Western blot鉴定siRNA对p115RhoGEF蛋白表达的抑制作用；(3) bEnd.3细胞转染p115RhoGEF-siRNA或给予RhoA抑制剂C3转移酶预处理,pull-down法检测LPS刺激后RhoA活性变化,TEER检测BMECs通透性改变,直接免疫荧光观察纤维状肌动蛋白(F-actin)变化,Western blot检测TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达变化。结果：(1)LPS作用bEnd.3细胞1h后,p115RhoGEF蛋白表达水平上调,3h达到高峰；(2)转染P115RhoGEF-siRNA的bEnd.3细胞p115RhoGEF蛋白表达较对照组明显减少；(3)C3转移酶组RhoA(?)性被完全抑制,LPS刺激后TEER值较对照组增高, ZO-1、occludin、claudin蛋白表达下降不明显；与C3转移酶组相比,抑制p115RhoGEF表达可部分抑制LPS诱导的RhoA(?)舌化、TEER下降及ZO-1表达减少；转染p115RhoGEF-siRNA和C3转移酶预处理可以减少LPS导致的F-actin重组。结论：成功构建p115RhoGEF-siRNA抑制bEnd.3的p115RhoGEF表达,证实P115RhoGEF/RhoA信号通路参与了LPS致BMECs通透性增高的调控。第三部分Rho信号通路与TNF-a致BMECs通透性增高相关目的：证实Rho信号通路与TNF-α致BMECs通透性增高相关。方法：(1)以培养至融合的小鼠BMECs株(bEnd.3细胞)为实验对象,Western blot检测RhoA,总蛋白表达,pull-down法检测TNF-α刺激后RhoA活性；(2)p115RhoGEF-siRNA转染bEnd.3细胞,Western blot鉴定转染细胞中p115RhoGEF蛋白表达的抑制情况；(3) p115RhoGEF-siRNA转染bEnd.3细胞,pull-down法检测TNF-α刺激后RhoA(?)舌性变化。(4) bEnd.3细胞随机分为对照组、TNF-α干预组和Y-27632预处理组,观察bEnd.3细胞TEER的变化。结果：RhoA(?0舌性在TNF-α刺激30min后明显增高并达到高峰,RhoA,总蛋白表达在TNF-α刺激12h和24h显著上调；TNF-α刺激30min, p115RhoGEF-siRNA组bEnd.3细胞RhoA活性较对照组明显降低；TNF-α使bEnd.3细胞TEER明显下降,Y-27632预处理能明显拮抗TNF-α的上述作用。结论：TNF-α可导致bEnd.3细胞单层通透性增高,Rho信号通路可能参与此过程的调控。