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目的宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,目前已明确人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是导致宫颈癌发生的主要原因,但并非唯一因素。叶酸是机体必需的微量营养素,它作为体内一碳单位的主要供体,参与DNA的甲基化过程,与肿瘤的发生发展关系密切。近年来的研究表明,叶酸缺乏可增加宫颈癌发生的风险。脆性组氨酸三联体(FHIT)基因为目前与宫颈癌关系较为密切的抑癌基因,FHIT蛋白覆盖染色体3p上的脆弱位点(FRA3B),而HPV16常常整合到FHIT基因的脆弱位点处。MeCP2蛋白可以反映DNACpG岛甲基化的状态,其表达异常与多种肿瘤发生有关。上述事件在宫颈癌变中的作用目前尚未见相关报道。本次研究采用宫颈癌细胞体外培养的方法,研究不同叶酸浓度下,HPV16阳性和HPV阴性宫颈癌细胞的增殖情况,以及两种细胞系中FHIT、MeCP2蛋白表达情况和mRNA表达水平的变化,并分析以上事件在宫颈癌发生中的关系。方法选择HPV阴性宫颈癌细胞株C33A和HPV16阳性宫颈癌细胞株CaSki进行常规培养,各取对数生长期细胞置于不同浓度叶酸条件下分组培养。以MTT法观察叶酸对两种细胞活性的影响;通过细胞计数来探讨叶酸对两种宫颈癌细胞增殖的影响;real time-PCR方法检测两种细胞中FHIT、MeCP2 mRNA、CaSki细胞HPV16 E2、E6 mRNA的表达情况;Western blotting检测两种细胞中FHIT、MeCP2蛋白表达情况。使用SPSS16.0软件分析数据,正态分布资料用t检验、方差分析,偏态资料分析用Wilcoxon检验和Kruskal-Wallis检验,回归关系采用Logistic回归分析。结果1.叶酸对两种宫颈癌细胞C33A和CaSki的活性和增殖的影响。通过MTT法可知,添加不同浓度叶酸可抑制两种细胞的活性,除C33A细胞的100μg/ml、500μg/ml浓度组、Caski细胞的10μg/ml、50μg/ml、750μg/ml浓度组,其它各叶酸实验组与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);随着叶酸浓度增加,两种细胞的生长相对抑制率随之上升。叶酸缺乏组与对照组相比,两组的差异有统计学意义(P<0.05)。随着叶酸浓度增加和培养时间延长,叶酸对细胞增殖的抑制作用逐渐增大。2.叶酸对FHIT表达的影响(1)叶酸对FHITmRNA表达的影响(a)不同叶酸浓度下FHIT mRNA表达情况在不同叶酸浓度下,C33A细胞中FHIT mRNA相对表达量差别有统计学意义(F=23.089,P=0.00),进一步多重比较结果显示,叶酸缺乏组和10 ug/ml浓度组与对照组相比均有统计学意义(P均小于0.05)。而Caski细胞中FHIT mRNA相对表达量差别无统计学意义(F=1.948 P=0.128)。(b)同一叶酸浓度下两种细胞FHIT mRNA表达情况在同一浓度下,除750 ug/ml和1000ug/ml浓度组,其他浓度组两种细胞FHIT mRNA相对表达量差别均有统计学意义(P均小于0.05)。(c)叶酸与FHIT mRNA表达的回归分析以FHIT mRNA相对表达量作为应变量,以叶酸浓度作为自变量,做直线回归分析。结果显示:叶酸浓度对FHIT mRNA相对表达量的影响有统计学意义,随着叶酸浓度的升高,FHIT mRNA相对表达量增高。(2)叶酸对FHIT蛋白表达的影响(a)不同叶酸浓度下FHIT蛋白表达情况在不同叶酸浓度下,C33A、Caski细胞中FHIT蛋白相对表达量差别有统计学意义(F=62.676 P=0.000,F=81.307 P=0.000),进一步多重比较结果显示,叶酸实验组组与对照组相比均有统计学意义(P均小于0.05)。(b)同一叶酸浓度下两种细胞FHIT蛋白表达情况在同一浓度下,1 ug/ml和0.1ug/ml浓度组FHIT蛋白相对表达量差别均有统计学意义(P均小于0.05)。(c)叶酸与FHIT蛋白表达的回归分析以FHIT蛋白相对表达量作为应变量,以叶酸浓度作为自变量,做直线回归分析。结果显示:在两种细胞中,叶酸浓度对FHIT蛋白相对表达量的影响有统计学意义;随着叶酸浓度的升高,蛋白相对表达量降低。3.叶酸对MeCP2表达的影响(1)叶酸对MeCP2mRNA表达的影响(a)不同叶酸浓度下MeCP2 mRNA表达情况在不同叶酸浓度下,C33A细胞中MeCP2 mRNA相对表达量差别无统计学意义(F=2.308 P=0.079)。Caski细胞中MeCP2 mRNA相对表达量差别有统计学意义(F=120.562 P=0.00),进一步多重比较结果显示,除50 ug/ml和750 ug/ml浓度组,其他各组与对照组相比均有统计学意义(P均小于0.05)。(b)同一叶酸浓度下两种细胞MeCP2 mRNA表达情况在同一浓度下,除0.1 ug/ml和100ug/ml浓度组,其他浓度组两种细胞MeCP2 mRNA相对表达量差别均有统计学意义(P均小于0.05)。(c)叶酸与MeCP2 mRNA表达的回归分析以MeCP2 mRNA相对表达量作为应变量,以叶酸浓度作为自变量,做直线回归分析。结果显示:C33A细胞中,叶酸浓度对MeCP2 mRNA相对表达量的影响有统计学意义,随着叶酸浓度的升高,MeCP2 mRNA相对表达量降低。CaSki细胞中,叶酸浓度对MeCP2 mRNA相对表达量的影响无统计学意义。(2)叶酸对MeCP2蛋白表达的影响(a)不同叶酸浓度下MeCP2蛋白表达情况在不同叶酸浓度下,C33A、Caski细胞中MeCP2蛋白相对表达量差别有统计学意义(F=40.594 P=0.000,F=37.805 P=0.000)。进一步多重比较结果显示,C33A细胞中叶酸实验组组与对照组相比均有统计学意义(P均小于0.05);而Caski细胞中500 ug/ml、750 ug/ml和1000ug/ml浓度组与对照组相比均有统计学意义(P均小于0.05)。(b)同一叶酸浓度下两种细胞MeCP2蛋白表达情况在同一浓度下,1 ug/ml、0.1ug/ml、750 ug/ml浓度组MeCP2蛋白相对表达量差别均有统计学意义(P均小于0.05)。(c)叶酸与MeCP2蛋白相对表达量的回归分析以MeCP2蛋白相对表达量作为应变量,以叶酸浓度作为自变量,做直线回归分析。结果显示:在两种细胞中,叶酸浓度对MeCP2蛋白相对表达量的影响有统计学意义;随着叶酸浓度的升高,蛋白相对表达量降低。4.叶酸对HPV16 E2、E6 mRNA表达的影响。不同浓度叶酸对CaSki细胞HPV16E2、E6基因mRNA表达水平的影响程度与对照组相似,差别未显示出统计学意义(P>0.05)。同一叶酸浓度下,HPV16E2、E6mRNA相对表达量差别无统计学意义。结论1.补充叶酸可抑制C33A和CaSki细胞增殖,且随着叶酸浓度增加和培养时间延长,这种作用呈增强趋势,提示叶酸有望应用于宫颈癌的预防和治疗。2.补充叶酸可使宫颈癌细胞中FHIT基因表达增高。HPV与FHIT在宫颈癌的发生中可能具有一定的关系。3.MeCP2受叶酸水平的影响,补充叶酸后,宫颈癌细胞中MeCP2表达水平降低。HPV与MeCP2在宫颈癌的发生中可能具有一定的关系。4.叶酸对CaSki细胞HPV16E2、E6基因mRNA的表达水平没有明显影响,提示叶酸可能对已癌变细胞内HPV16病毒转录的影响微弱。