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细胞因子信号转导抑制因子(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)是一大类由多种细胞因子、病原微生物及其产物诱导产生的胞内调控蛋白,可与细胞因子受体或Janus激酶(Janus Kinase,JAK)相互作用,降低细胞因子的信号传导,在调控机体免疫细胞的增殖与分化、炎症性疾病、肿瘤的发生和内环境稳态等多种生理过程中发挥重要作用。卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国南方重要的海洋养殖鱼类,其SOCS研究迄今未见报道。本研究应用RT-PCR、巢式PCR和RACE等技术获得卵形鲳鲹Ⅱ型SOCS基因,即TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3的全长c DNA,长度分别为1599 bp、1909 bp、1688 bp和2124 bp,其中ORF分别为681 bp、717 bp、603 bp和618 bp,预测编码226、238、200和205氨基酸。TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3蛋白具有SOCS蛋白的典型特征,均有SH2结构域和SOCS-box结构域。同源性分析表明TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3蛋白与其它鱼类的相应蛋白同源性较高(分别为40.2-86.3%、51.3-86.0%、72.1-94.0%和63.1-92.75%)。进化树显示TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3均与其它鱼类的亲缘关系最近,与其它脊椎动物亲缘关系较远。以上结果表明卵形鲳鲹Ⅱ型SOCS在进化上相对保守,推测其功能与哺乳动物的相似。qPCR检测表明,TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3基因m RNA在所检组织(皮肤、肌肉、鳃、头肾、脾脏、心脏、肝脏和肠)均有表达,但表达水平存在差异。其中TroCISH在头肾的表达量最高,其次是肝脏和脾脏;TroSOCS1在肝脏的表达量最高,其次是肠和脾脏;TroSOCS2在心脏的表达量最高,其次是肝脏和脾脏;TroSOCS3在皮肤的表达量最高,其次是肝脏和鳃;TroCISH、TroSOCS1和TroSOCS2在肌肉的表达量最低,而TroSOCS3在头肾的表达量最低。这些表达特征说明卵形鲳鲹Ⅱ型SOCS与免疫应答有关。LPS刺激后,TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3在头肾、肝脏和脾脏中的表达量均显著升高(P<0.05),在肌肉中升高但无显著差异。其中,TroCISH在头肾、肝脏和脾脏中显著升高的时间点均为刺激后6、12、24和48 h;TroSOCS1在头肾和脾脏显著升高的时间点与TroCISH的相同,而在肝脏中显著升高的时间点为刺激后6、12和24 h;TroSOCS2在肝脏和脾脏中表达显著升高的时间点为刺激后6和12 h,而在头肾中表达显著上升的时间点为刺激后6 h;TroSOCS3在头肾、肝脏和脾脏中表达显著升高的时间点为刺激后6、12和24 h。这些变化表明4个SOCS基因均参与了由LPS诱导的免疫反应。polyl:C刺激后,检测发现TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3在头肾、脾脏和肝脏中的表达显著上调(P<0.05),而在肌肉中表现为不显著上调。其中,TroCISH在头肾和脾脏中显著上调的时间点为刺激后12和24 h,在肝脏显著上调的时间点为刺激后12 h;TroSOCS1在头肾、肝脏和脾脏中显著上调的时间点为刺激后6、12和24 h;TroSOCS2在头肾显著上调的时间点与TroSOCS1的相同,在肝脏显著上调的时间点为刺激后6和12 h,在脾脏显著上调的时间点为刺激后12和24 h;TroSOCS3在头肾中显著上调的时间点为刺激后6和12 h,在肝脏中显著上调的时间点为刺激后6和24 h,而在脾脏中显著上调的时间点为刺激后12 h。以上结果表明4个SOCS基因均与机体抗polyl:C的免疫反应有关。溶藻弧菌感染后,检测发现肝脏、头肾和脾脏组织中的TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3 m RNA表达水平均显著上调(P<0.05),而在肌肉中上调不显著。但在不同组织中这些基因的表达水平达到峰值的时间点不完全相同:TroCISH在头肾、脾脏和肝脏中表达量达到峰值的时间点分别为感染后12、12和24 h;TroSOCS1在头肾、脾脏和肝脏中表达量达到峰值的时间点分别为感染后6、12和24 h;TroSOCS2在头肾、脾脏和肝脏中的表达量达到峰值的时间点分别为感染后24、24和12 h;TroSOCS3在头肾、脾脏和肝脏中的表达量达到峰值的时间点分别为感染后12、24和24 h。上述结果说明了Ⅱ型SOCS在抗细菌的免疫反应发挥作用。将TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3基因的编码区分别克隆至p ET-32a,构建了原核表达载体(p ET32a-CISH、p ET32a-SOCS1、p ET32a-SOCS2和p ET32a-SOCS3)。然后转化至大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE显示4个重组质粒均以可溶性蛋白形式表达,将表达蛋白通过Ni-IDA琼脂糖树脂柱纯化。Western blot检测显示4个纯化重组蛋白均能与小鼠抗His标签的单克隆抗体反应,分别在靠近45.0 k Da处出现特异性蛋白条带。结果表明成功得到了TroCISH、TroSOCS1、TroSOCS2和TroSOCS3重组蛋白。综上所述,本研究克隆获得卵形鲳鲹Ⅱ型SOCS基因,检测了Ⅱ型SOCS在正常组织的分布情况和LPS、polyl:C和溶藻弧菌刺激后的表达规律,并纯化得到Ⅱ型SOCS重组蛋白。这些结果丰富鱼类免疫学知识,并为进一步研究卵形鲳鲹Ⅱ型SOCS在先天免疫中的作用机制奠定基础。