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第一部分:Panx3通过抑制NF-κB通路抑制TNF-α诱导的炎症反应研究目的:本实验第一部分探讨Panx3调控牙髓干细胞炎症反应的作用及其机制。材料与方法:临床收集正常恒牙及炎症牙髓组织,构建大鼠急性牙髓炎模型,收取组织样本,进行HE及免疫组织化学染色,检测Panx3在正常与炎症牙髓组织中的表达差异。相应浓度的TNF-α、BAY 11-7082、MG132刺激hDPSCs特定的时间后,qRT-PCR与Western blot检测Panx3的表达变化。利用慢病毒载体系统过表达及抑制Panx3的表达,然后添加TNF-α,qRT-PCR与ELISA检测炎症因子IL-6、IL-1β的表达。双萤光素酶实验、Western blot、免疫荧光实验检测Panx3对NF-κB通路的影响。添加BAY 11-7082后,qRT-PCR与ELISA检测炎症因子IL-6、IL-1β的表达。实验结果:炎性牙髓组织中TNF-α表达增高,而Panx3表达降低。TNF-α对hDPSCs中Panx3的表达呈浓度依赖性抑制。MG132可以逆转TNF-α对Panx3的抑制作用;与之相反,BAY 11-7082无法逆转该过程,单独添加BAY 11-7082甚至减少Panx3的表达。hDPSCs过表达Panx3后,TNF-α诱导的IL-6、IL-1β的表达降低;而Panx3沉默增加IL-6、IL-1β的表达。双萤光素酶实验、Western blot、免疫荧光实验证明Panx3过表达降低NF-κB转录活性,而Panx3干扰增加NF-κB转录活性。BAY 11-7082预处理hDPSCs/shRNA组,IL-6、IL-1β的表达降低。结论:TNF-α通过激活蛋白酶体途径降解Panx3,同时NF-κB通路可以平衡此过程。Panx3可以通过抑制NF-κB通路抑制TNF-α诱导的炎症反应。第二部分:Panx3对hDPSCs成骨及成牙本质向分化的影响研究目的:本部分研究目的为探索Panx3在hDPSCs分化过程中的作用,并阐述其调控分化的机制。材料与方法:通过qRT-PCR与Western blot检测Panx3的mRNA与蛋白表达在分化过程中的变化。用慢病毒转染系统进行Panx3过表达及干扰,CCK-8检测Panx3过表达或者干扰对hDPSCs增殖能力的影响。qRT-PCR、Western blot、ALP活性、ALP染色、茜素红染色检测Panx3过表达或者干扰对hDPSCs分化能力的影响。Western blot、双萤光素酶实验、qRT-PCR、免疫荧光实验检测Panx3对Wnt/β-catenin通路的影响。qRT-PCR与Western blot检测LiCl对Panx3过表达及Panx3干扰的hDPSCs分化的影响。生物信息学分析Panx3启动子区域含有TCF/LEF转录因子结合位点。Western blot、免疫荧光实验、双萤光素酶实验检测Wnt/β-catenin对Panx3的转录调控。Western blot、qRT-PCR、ALP活性、茜素红染色检测Panx3过表达对ERK1/2通路的影响。实验结果:Panx3分化过程中表达呈现波动状改变。过表达Panx3显著抑制细胞增殖促进细胞分化,而Panx干扰促进细胞增殖抑制细胞分化。Panx3过表达抑制Wnt/β-catenin活性,而Panx3干扰增加Wnt/β-catenin转录活性。LiCl增加hDPSCs/Panx3与hDPSCs/shRNA组的分化相关指标。LiCl、Wnt3a促进Panx3的蛋白表达,呈浓度依赖性;β-catenin干扰抑制Panx3的蛋白表达。LiCl促进Panx3的胞浆胞膜表达。手动搜索哺乳动物Panx3启动子区域后发现,人、狗、鼠等哺乳动物Panx3启动子区域均有TCF/LEF转录结合位点。双萤光素酶结果显示,LiCl促进Panx3启动子的转录活性。Panx3过表达上调phosphor-ERKl/2蛋白表达,U0126降低Panx3过表达组分化相关指标。结论:Panx3可以与Wnt/β-catenin相互作用,但Panx3对hDPSCs的分化作用的调节并不依赖于Wnt/β-catenin通路,而是通过激活ERK1/2通路。第三部分:过表达Panx3的hDPSCs联合β-TCP支架对临界性骨缺损的修复能力实验目的:此部分旨在检测Panx3过表达修饰的hDPSCs联合β-TCP支架对大鼠颅骨临界性骨缺损的修复能力。材料与方法:hDPSCs细胞悬液接种于β-TCP支架,鬼比环肽染色检测hDPSCs在支架上的伸展及分布情况。构建大鼠颅骨临界性骨缺损,hDPSCs联合β-TCP支架植入颅骨缺损模型。实验分为四组:(1)空白组(n = 6);(2)β-TCP组(n = 6);(3)hDPSCs/Panx3-β-TCP 组(n = 6);(4)hDPSCs/Plvx-β-TCP 组(n = 6)。术后八周,处死大鼠,取出颅骨,Micro-CT、组织化学染色检测各组的新生骨量。双免疫荧光检测新生骨的细胞来源。实验结果:共聚焦显微镜结果显示,细胞在β-TCP伸展良好,呈三维分布。Micro-CT结果、组织化学染色结果显示:8周后,hDPSCs/Panx3-β-TCP组新生骨量最多,空白组几乎没有新骨形成,在β-TCP组,少量的新骨形成。TRAP阳性细胞出现在新生骨表面。荧光双染结果表明,宿主细胞及供体细胞均参与新骨形成。结论:Panx3过表达hDPSCs可以促进颅骨缺损的修复,成为骨组织工程非常有潜力的种子细胞。