骨肉瘤是最常见的原发于骨组织的恶性肿瘤,多见于青少年,具有局部侵犯和早期发生远处转移的特点。尽管采用最新的新辅助化疗+手术+术后化疗的治疗策略后患者的5年生存率能达到60-80%左右,然而一旦发生化疗耐药或复发,则预后极差。另外,骨肉瘤的一线化疗方案核心药物(甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂,MAP方案)已延用几十年之久,临床上对化疗耐药的患者手段十分有限。因此,若能寻找一个除了常规手术、化疗、放疗之外的治疗方法,将会是对常规疗法的极大补充。免疫治疗并被誉为是除三种常规疗法之外的"第四种疗法"。过继性细胞输注治疗是重要的免疫治疗手段之一,近期在临床试验中尤其是对白血病取得了极大突破。然而相比较于白血病,绝大多数实体肿瘤都缺少特异性强、表达率高的免疫治疗靶点,而且实体肿瘤的肿瘤微环境也从多个方面阻止效应免疫细胞对肿瘤细胞的攻击,骨肉瘤亦有这些特点。因此,如何对骨肉瘤进行安全、有效的过继性细胞输注免疫治疗是时下的难点。肿瘤/睾丸抗原几乎只存在于恶性肿瘤和免疫逃逸区,是特异性很强的肿瘤特异性抗原。但其在骨肉瘤上表达率差别很大,且常常处于高甲基化状态导致表达降低乃至沉默。另外,肿瘤细胞可以通过异常的高甲基化使诸多抑癌基因沉默,并影响某些与免疫反应直接相关的蛋白质的表达。我们使用去甲基化药物地西他滨对骨肉瘤细胞系进行治疗后,发现肿瘤/睾丸抗原在骨肉瘤细胞中的表达得到显著提高,且提高的抗原表达能成功被体外培养的肿瘤/睾丸抗原特异性CD8+T细胞识别。另外,去甲基化治疗本身对骨肉瘤细胞有杀伤作用;在联合T细胞治疗后,杀伤率得到进一步提高。我们随后使用人骨肉瘤细胞系在免疫缺陷鼠建立皮下荷瘤模型,对小鼠进行去甲基化治疗和人源CD8+T细胞输注治疗,并使用小动物活体成像系统监测输注入小鼠体内的T细胞分布。我们发现只有在经过去甲基化治疗的小鼠中,肿瘤/睾丸抗原特异性CD8+T细胞才能归巢至肿瘤区域。治疗过程中测量肿瘤大小、治疗结束后肿瘤称重均提示联合治疗能显著抑制肿瘤生长。但去甲基化治疗单药治疗对在体的骨肉瘤效果不明显,只有在联合T细胞输注后才显示出抗肿瘤效果。我们同时还使用鼠骨肉瘤细胞系在免疫健全鼠建立原位模型,对小鼠进行去甲基化治疗,检测去甲基化治疗对肿瘤局部免疫反应的影响。我们发现去甲基化治疗促进了肿瘤灶的淋巴细胞浸润,并提高了肿瘤内CD8+T细胞的活性,且这些效果具有剂量依赖性。我们进一步探索去甲基化治疗促进肿瘤内淋巴细胞浸润的可能机制时,发现可能与趋化因子CXCL12的表达量有关。骨肉瘤存在着高甲基化的CXCL12,从而导致CXCL12表达量降低、T细胞归巢减弱。而去甲基化治疗能提高骨肉瘤的CXCL12表达,为T细胞归巢创造条件。综上,本研究表明去甲基化治疗能促进骨肉瘤局部的免疫反应,并能诱导肿瘤/睾丸抗原特异性CD8+T细胞趋化、识别骨肉瘤,进而有效地控制骨肉瘤生长。