几丁酶-蛋白酶融合基因的构建与球孢白僵菌毒力的提高

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昆虫病原真菌是一类重要的生防真菌,在农林害虫的防治上起着重要的作用。它主要通过机械压力和水解酶的作用来穿透昆虫体壁,Pr1类蛋白酶和几丁质酶在其中起着重要作用。前人的研究表明,超量表达蛋白酶或几丁酶基因可以提高重组菌株的毒力,但目前对于二者在穿透昆虫体壁时是否存在协同作用还不清楚。 为了研究蛋白酶和几丁酶在昆虫病原真菌穿透寄主体壁时的相互作用,本文首先用扫描电镜观察了被蛋白酶CDEP-1、几丁酶Bbchit1及二者混合酶液处理过的桃蚜体壁,结果表明,蛋白酶与几丁酶混合液分解寄主体壁的能力更强。 进而将球孢白僵菌Pr1类蛋白酶基因CDEP-1分别与几丁酶基因Bbchit1和Machit1融合,分生孢子电击转化法将融合基因导入球孢白僵菌中。Northern blotting和Western blotting结果证明,这些基因均在重组菌株中组成性转录和表达。 生物测定结果表明,超量表达CDEP-1、Bbchit1单价基因及二者融合基因CDEP-1::Bbchit1均能提高重组菌株对桃蚜的毒力,且融合基因重组菌株的毒力提高幅度更大。在孢子浓度为1×107个/ml时,与野生型菌株Bb0062-15相比,超量表达蛋白酶CDEP-1基因重组菌株的致死中时(LT50)平均缩短了8.84%;超量表达几丁酶Bbchit1基因重组菌株的LT50平均缩短了9.92%;而融合基因CDEP-1::Bbchit1重组菌株的LT50平均缩短了21.12%。接种108h及120h后,融合基因CDEP-1::Bbchit1重组菌株CDEP-1::Bbchit1-41的致死中浓度(LC50)分别降低了67.42%和60.50%,下降幅度分别为CDEP-1-6和Bbchit1-26 LC50之和的2.22(108h)和1.65倍(120h)。表明超量表达融合基因CDEP-1::Bbchit1能协同提高球孢白僵菌对寄主的毒力。 生物测定结果还表明,单独超量表达绿僵菌几丁酶Machit1基因不能提高重组菌株的毒力,但超量表达融合基因CDEP-1::Machit1的重组菌株却能显著提高球孢白僵菌的毒力。在孢子浓度为1×107个/mL时,超量表达融合基因CDEP-1::Machit1重组菌株的LT50平均缩短了18.07%;在108h及120h时,CDEP-1::Machit1-37的LC50分别比野生型菌株缩短了38.89%(108h)和41.68%(120h),均低于相应浓度及时间下蛋白酶基因CDEP-1重组菌株的LT50及LC50。 上述结果表明,昆虫病原真菌的蛋白酶和几丁质酶在分解昆虫体壁时,存在协同作用。据我们所知,目前尚无同类报道。
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