氧是需氧生物正常生命活动的必要条件,动物可通过调节自身代谢适应短期的低氧或高氧环境。氧浓度变化会影响动物的生长发育和繁殖,尤其在心血管方面表现明显。水中溶解氧容易发生改变,对水生动物的代谢影响显著。鱼类受高氧或低氧胁迫后会引发各种生理应答,胁迫消除后机体会产生补偿现象,但生长发育仍受影响,严重时诱发疾病并影响生存。目前溶氧对鱼类影响的研究集中在成鱼的生理响应,对于胚胎发育时期的影响较少涉及。高氧和低氧条件下对胚胎生长发育、心血管发育情况及调控机制尚不清楚。本研究以斑马鱼(Danio rerio)作为实验模型,选择心脏、血管荧光标记的两个品系斑马鱼为实验材料,设定低氧(2.0±0.5mg/L)、常氧(6.0±0.5mg/L)和高氧(15.5±0.5mg/L)三种溶氧条件,用荧光显微镜观测24-72hpf胚胎形态结构,心脏和血管外部形态,心率,胚胎躯干部主要血管背主动脉(DA)和后主静脉(PCV)直径,背部纵向血管(DLAV)到PCV的距离,相邻体节间血管(ISV)距离,脊索旁血管(PAV)的形成情况。结果显示,常氧条件下胚胎存活率为74.18±4.23%,高氧下存活率为76±4.09%,而低氧下胚胎的存活率仅为43.98±1.94%。低氧不仅使滞后胚胎发育,且造成形态异常,如胚体较常氧短、头部窄、眼小、卵黄吸收障碍、卵黄延伸延迟。高氧在一定时间内促进胚胎发育,如发育到常氧组24h形态标准时,所需时间为18-22h,而低氧条件下需要48-72h。高氧除诱导胚胎黑色素沉积增多,眼径增大(胚胎形态发育到48hpf时,常氧组和高氧组胚胎的眼径分别为253.0±20.7μm和268.3±14.7μm),其余体征与正常胚胎无异。低氧胁迫后的斑马鱼胚胎心包水肿、心管发育停滞,心脏虽有房室之分,但其却不能向右环化。长时高氧导致心跳减弱,其余并无显著影响。常氧和低氧组DA直径分别为27.5±3.6μm和19.1±3.8μm,PCV直径分别为35.7±5.4μm和23.0±5.8μm,PCV到DLAV距离分别为181.7±5.8μm和143.7±16.5μm。由此可知,低氧使胚胎DA和PCV直径变窄、PCV到DLAV距离变短。此外,低氧还导致ISV生长轨迹异常,PAV特异性消失。高氧仅增加DA直径(30.8±5.0μm),对其他血管无显著影响。为进一步探讨低氧和高氧影响斑马鱼胚胎心血管发育的机制,使用整胚原位杂交(ISH)和qPCR检测溶氧对心血管发育相关基因表达部位和表达量的改变。根据NCBI上的序列信息,使用PCR技术克隆心脏特异性标记基因Cmlc2、血管内皮生长因子Aggf1、血管内皮生长因子受体-3(Flt4/VEGFR-3)的cDNA序列,合成地高辛标记的核酸探针用于ISH。通过qPCR检测Cmlc2、Aggf1、Flt4、血管内皮生长因子受体-2(Flk1/VEGFR-2)及T-盒转录因子(T-box)家族中Tbx5表达量的变化。心血管发育基因胚胎原位杂交结果表明,Cmlc2表达部位不受溶氧影响,但通过Cmlc2标记观察到低氧诱导心脏环化障碍。低氧和高氧对Aggf1的表达部位及表达量无显著影响。Flk1在低氧组胚胎的ISV血管表达特异性消失,高氧组表达无明显变化。Flt4在低氧组胚胎头部的表达缺失,但躯干部的表达增加,高氧组表达无明显差异。相对qPCR结果表明:低氧和高氧使Cmlc2表达量下调,均具极显著差异(P<0.01)。Tbx5表达量上调,分别具有极显著差异(P<0.01)和显著差异(P<0.05)。Aggf1表达下调,均具有显著差异(P<0.05)。Flk1表达下调,均具有极显著性差异(P<0.01)。Flt4表达表达上调,分别具极显著差异(P<0.01)和显著差异(P<0.05)。qPCR结果佐证了原位杂交中低氧胁迫的结果,同时检测到高氧对这些基因的表达有影响。根据以上基因在心脏和血管发育中的功能,提示低氧可能通过Tbx5影响心脏的环化过程,心脏环化障碍是低氧引起心脏发育异常的始发环节。低氧可能通过VGEF/VGEFR途径和Notch信号途径影响胚胎血管的正常发育。尽管高氧对胚胎形态发育影响较小,但也可能通过VGEF/VGEFR途径影响心血管基因的表达。综上,低氧导致斑马鱼胚胎发育显著滞后,心脏、血管形态发育缺陷,发育相关基因表达异常。高氧对胚胎发育有一定促进作用,对心脏、血管相关基因表达也存在一定影响,但心血管形态学变化不明显。斑马鱼早期胚胎发育受低氧和高氧胁迫后对成体的形态结构和生理机能有何影响,还需进一步研究。