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肠道菌群在人类健康和疾病中起着重要的作用。肠黏膜表面的黏膜层是肠细胞与肠道菌群相互作用的场所,对维持肠道健康和肠道微生态平衡至关重要。黏蛋白2（Muc2）是肠黏膜层的主要成分。黏蛋白基因家族中有17个人类黏蛋白基因,根据其不同的结构主要分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白两大类,其中Muc2是第一个被克隆并完全测序的人类分泌型黏蛋白基因,它主要由人结肠和小肠的杯状细胞表达,是小肠和大肠黏液的主要成分。Muc2已被证明是对抗外部病原体的重要保护屏障,与多种癌症疾病相关,如结直肠癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌。在CRC中Muc2过表达有助于肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫效应分子的识别从而促进CRC的发展。Akkermansia muciniphila是肠道菌群的重要组成部分,具有多种生物学功能,如通过自身的蛋白水解酶调节Muc2的水平。Akkermansia muciniphila利用黏蛋白作为其生长唯一的碳源和氮源,还能产生多种降解黏蛋白的蛋白,但目前尚不清楚哪些蛋白可以降解黏蛋白。本论文工作主要包括三个部分:第一部分,从Akkermansia muciniphila基因库中选择一个编码假定蛋白的基因Amuc-1434,通过原核表达系统纯化重组蛋白Amuc-1434,探究其活性和基本的酶学性质。第二部分,主要制备和评估重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,研究重组蛋白Amuc-1434与结直肠癌细胞系LS174T细胞表达的Muc2之间的相互作用和其降解Muc2的能力,并研究蛋白Amuc-1434在小鼠肠道中的表达位置。第三部分,主要探究重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞增殖、周期、凋亡、ROS水平和线粒体膜电位的影响及其发挥作用的机制。第一部分:重组蛋白Amuc-1434的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究首先委托华大基因（公司）全基因合成了含有组氨酸标签的Amuc-1434重组质粒,重组的Amuc-1434以pET25b（+）为载体,酶切位点为BamH?和Xho?。将重组的Amuc-1434转到表达菌E.coli Rosetta感受态细胞中,经氨苄和氯霉素抗性筛选得到E.coli Rosetta-pET25b（+）-Amuc-1434转化子,通过对诱导条件的优化,确定在诱导时间为4 h、诱导剂IPTG浓度为1.0 mM、诱导温度为37℃条件下可以实现重组蛋白Amuc-1434的可溶表达。采用Ni2+-NTA亲和层析纯化了重组蛋白Amuc-1434,并通过Western blot鉴定了纯化结果。在接下来的测活实验中,通过紫外分光光度法发现重组蛋白Amuc-1434能够水解血红蛋白,活性为17.21 U/μg。通过动力学分析发现重组蛋白Amuc-1434对血红蛋白的Km值为0.22μM,Vmax值为0.26μM/min,Kcat值为0.18 min-1,催化效率(Kcat/Km)为0.82/min/μM。我们还发现重组蛋白Amuc-1434的浓度与水解血红蛋白的酶促反应速率呈正相关。重组蛋白Amuc-1434于pH 8.0和40℃条件下具有最佳水解活性,并且在40℃下具有良好的热稳定性,半衰期大于4 h。通过抑制剂Pepstatin A预处理,我们鉴定出重组蛋白Amuc-1434属于天冬氨酸蛋白酶家族的一员。通过不同金属离子预处理,我们发现Ca2+和Mn2+的存在能够显著提高重组蛋白Amuc-1434的活性。随后,我们发现将重组蛋白Amuc-1434含有的天冬氨酸蛋白酶保守位点“DTG”和“LLG”突变为“AAA”后,得到的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG仍然具有活性,为此,我们得出结论蛋白Amuc-1434的活性中心与“DTG”和“LLG”无关,可能涉及其序列中的其他天冬氨酸。第二部分:重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体的制备、对Muc2的降解及其在小鼠肠道中表达位置的研究本研究制备了重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,通过ELISA检测其效价为1:4000,通过Western blot验证其特异性良好,通过HPLC鉴定其纯度可达89.72%。Dot-blot实验和细胞黏附实验表明,重组蛋白Amuc-1434与LS174T细胞表达的Muc2之间存在相互作用,并且重组蛋白Amuc-1434浓度越高,它们之间相关作用越强。ELISA实验发现这两个蛋白间的作用表现为重组蛋白Amuc-1434对Muc2的降解作用。此外,Western blot和免疫荧光实验也发现重组蛋白Amuc-1434可以降解Muc2。随后,通过免疫组化实验发现蛋白Amuc-1434主要表达在BALB/c小鼠的结肠中。第三部分:重组蛋白Amuc-1434对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究本研究通过MTT法发现重组蛋白Amuc-1434可以抑制LS174T细胞增殖,并且和其降解Muc2的能力有关。流式细胞术分析显示重组蛋白Amuc-1434会使LS174T细胞周期阻滞在G1期,并且上调细胞周期相关蛋白p53的表达。流式细胞术分析还表明重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡,也能升高LS174T细胞内和线粒体相关的ROS水平。荧光显微镜观察表明重组蛋白Amuc-1434下调LS174T细胞线粒体膜电位。本研究通过Western blot发现重组蛋白Amuc-1434通过上调死亡配体TRAIL和与之结合的死亡受体DR4和DR5的表达激活了外源性死亡受体途径,活化形式的Caspase 8和Caspase 3被检测到表达上调,这可能是重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡和抑制LS174T细胞增殖的原因。我们还发现由于Caspase 8的激活,重组蛋白Amuc-1434又间接激活线粒体途径,引起线粒体途径中凋亡相关蛋白表达的变化。研究结果显示,重组蛋白Amuc-1434诱导促凋亡蛋白Bid和Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,线粒体释放因子CytC、EndoG以及活化形式的Caspase 9表达上调,从而促进LS174T细胞凋亡。本篇论文首次表达纯化了来源于Akkermansia muciniphila的假定蛋白Amuc-1434,并发现其基本的酶学性质和天冬氨酸蛋白酶的属性,同时发现重组蛋白Amuc-1434具有降解Muc2的能力和通过上调TRAIL的表达激活细胞凋亡途径进而抑制LS174T细胞增殖的功能特性。