第一篇、植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的克隆及其植物表达载体的构建。 植物口服疫苗，成本低廉，使用简便，可规模化生产，且具有完整的真核细胞表达系统；果蔬类植物如番茄、香蕉等以其独具的可食（饲）性在疫苗研制方面展示了良好的开发应用潜能。目前已有多种疫苗分子在转基因植株中得到表达，部分植物疫苗经动物实验和志愿者的口服免疫测试结果表明：其可有效激发机体产生特异性的局部粘膜免疫反应和全身体液免疫、细胞免疫反应。 宫颈癌：女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，每年约有51万妇女被诊断为宫颈癌，其中约28．8万的死亡病例。近20年来对宫颈癌的病因及癌变机制的研究表明人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是宫颈癌的主要致癌因素，近99%的宫颈癌组织中可检出HPV DNA。因此，控制HPV感染必将减少肿瘤的发病率。HPV晚期基因编码的病毒主要结构蛋白（衣壳蛋白）L1具有自我组装的功能，在HPV病毒颗粒的形成过程中起到了包装病毒DNA的作用，在许多表达系统中，衣壳蛋白可以在体外合成不含病毒DNA的类病毒颗粒（viruslike particles，VLPs），它可诱导出特异性针对HPV衣壳蛋白的免疫反应，是宫颈癌预防性疫苗的关键靶点。Gardasil和Cervarix HPV VLP预防性宫颈癌疫苗的上市，意义重大，但其价格高昂，在发展中国家广泛应用存在困难。植物基因工程的发展，给宫颈癌疫苗研制带来新的思路，探索研制价廉易用的果蔬型植物口服疫苗，对宫颈癌的防治意义重大。 本研究以植物偏爱密码子对HPV18L1基因进行改造，以期获得改造后的HPV18L1全长基因（mHPV18Ll），并构建以E35S-E8嵌合型启动子驱动的重组质粒：中间载体pB35E8-18L1及植物表达载体pC35E8-18L1，为进一步深入研发HPV转基因植物口服疫苗研究奠定前期工作基础。 目的：设计合成植物偏爱密码子优化后的mHPV18L1全长基因，并构建由嵌合型启动子E35S-E8驱动mHPV18L1的植物表达载体。 方法： 1．自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列，经生物信息学分析后选定目标序列，经Synthetic Gene Designer及JCat （Java Codon Adaptation Tool）分析软件将此序列原始密码子改造为植物偏爱密码子，在C端加入蛋白纯化标签His-tag，获得改造后的mHPV18L1全长序列； 2．将mHPV18L1亚克隆入pMD18T-mHPV18L1重组质粒，并进行酶切分析和测序鉴定以确证； 3．选择嵌合型启动子E35S-E8驱动mHPV18L1，亚克隆构建中间载体和植物表达载体，并进行酶切和测序鉴定。 结果： 1．通过重叠PCR合成了植物密码子优化的mHPV18L1全长基因，构建了重组质粒pMD18-T-mHPV18L1。 2．成功构建由嵌合型启动子驱动mHPV18L1的中间载体pB35E8-18L1和植物表达载体pC35E8-18L1。 结论：成功获得植物偏爱密码子优化后的mHPV18L1全长基因及E35S-E8嵌合型启动子驱动的植物表达载体pC35E8-18L1，为后续mHPV18L1在植物中的转化、表达奠定了一定的工作基础。 第二篇、嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1在转基因番茄中的表达研究。 番茄是广为人们喜爱且可生食的果蔬类植物，另其有较为成熟的再生、转化技术体系，在转基因植物口服疫苗研究中，番茄作为重要的转基因植物受体一直备受青睐。然而，以农杆菌介导的基因组稳定转化体系可能出现的位置效应和转基因沉默而导致的外源目的基因的表达效能低下，依然是需要解决的重要问题。正确选择能启动外源目的基因高效能表达的启动子是植物反应器研究中的关键环节。 本室前期有关弓形虫转基因番茄口服疫苗的系列研究呈示：E35S-E8嵌合型启动子具有优于常用植物组成型E35S启动外源基因表达的潜能。本研究正是基于此工作基础，对E35S-E8嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1在转基因番茄中的表达进行了深入的研究，对在番茄中表达的重组tSAG1进行了表达量、稳定性以及免疫反应性的鉴定，旨在为后续弓形虫转基因番茄口服疫苗研究筛选获得高效能表达具有免疫学活性tSAG1转基因番茄品系以实施下一步的动物口服免疫实验，同时也为HPV及其他疾病疫苗分子（如本论文第一篇中的mHPV18L1）在转基因番茄中的表达研究提供含具有高效能启动活性的启动子在内的优化表达体系。 目的：对E35S-E8嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1在转基因番茄植株中的表达量、稳定性及其免疫反应性进行鉴定。 方法： 1．E35S-E8嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1转基因番茄植株的筛选与培育。 2．采集转基因番茄叶片，CTAB法提取基因组DNA，针对原构建的弓形虫tSAG1植物表达载体，选取其调控元件E35S和NOS3’，筛选标记NPT Ⅱ以及目的基因tSAG1进行转基因植株基因组DNA的PCR检测。 3．提取转基因番茄植株蛋白进行SDS-PAGE、Western blot、ELISA分析。 结果： 1．对提取的DNA进行NOS、35S、NPT Ⅱ、tSAG1四个转基因成分的PCR扩增，均得到预期大小的目的片段，证实弓形虫tSAG1在转基因番茄基因组中的正确整合。 2．转基因番茄叶片总蛋白经SDS-PAGE分析结果呈示：所筛选获得12株E35S-E8嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1的转基因番茄植株在预期24．3kDa处出现明显表达带，其中1株tSAG1重组蛋白含量可达番茄可溶性总蛋白10%以上。 3．进一步经Western blot证实番茄表达的tSAG1重组蛋白能与HRP标记的SAG1的两株McAb K7H3和Y3A8，以及弓形虫速殖子可溶性抗原免疫兔血清发生强反应；将此表达带经切胶电渗分离纯化并进行Western blot鉴定后，用于ELISA检测小鼠动物模型和人血清IgG抗体，结果表明其具有良好的敏感性和特异性。 结论： 1．筛选获得12株E35S-E8嵌合型启动子驱动的弓形虫tSAG1转基因番茄植株，tSAG1获得高效稳定表达，重组蛋白具有良好的免疫反应性。 2．E35S-E8嵌合型启动子具有良好的启动活性，初步构建高效稳定表达外源蛋白的转基因番茄体系，为后续的弓形虫tSAG1转基因番茄口服疫苗的动物实验，以及mHPV18L1对番茄的进一步转化研究奠定了良好的工作基础。