叶螨载脂蛋白D适应取食相关氧化胁迫的功能研究

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叶螨是一类体型小且繁殖力强的世界性害螨,属典型的r对策生物。叶螨的寄主范围相当广泛,达3800多种,但目前对其广泛的寄主适应性的机制仍未完全清楚。植物在与植食性昆虫(螨)长期的相互作用及协同进化过程中,形成了广泛的防御机制抵御昆虫(螨)取食。但作为固着生物,植物严重依赖化学物质进行防御。在植物受到昆虫(螨)取食时,活性氧快速在细胞内大量积累,形成氧化爆发,对昆虫(螨)形成氧化压力。同时,昆虫(螨)在代谢植物防御性的次生代谢物质时,亦会导致氧化胁迫。活性氧高度活跃,能够诱导DNA和蛋白质氧化,同时攻击多不饱和脂肪酸,形成过氧化脂质,引发链式反应。载脂蛋白D(ApoD)是一种小分子分泌性糖蛋白,与控制脂质过氧化水平密切相关,能够降低过氧化脂质带来的氧化损伤。叶螨ApoD的进化及是否参与氧化胁迫的适应尚不清楚。据此,本学位论文在全基因组水平鉴定3种叶螨的ApoD,解析其表达模式及在取食过程中对叶螨的保护作用,研究结果对于理解叶螨广泛寄主适应的机制具有重要生物学意义。主要结果如下:1.叶螨ApoD数量剧烈扩张基于3种叶螨(二斑叶螨、柑桔全爪螨和苹果全爪螨)、哺乳动物人和小鼠以及重要目昆虫(黑腹果蝇、蚜虫、家蚕、斜纹夜蛾、烟粉虱、褐飞虱、白纹伊蚊和马铃薯叶甲)的基因组数据,利用HMMER和Blast分别在全基因组水平鉴定了ApoD基因信息。结果显示,哺乳动物人和小鼠基因组均只有1个ApoD基因;双翅目昆虫黑腹果蝇和白纹伊蚊分别有2个和7个ApoD基因;鳞翅目昆虫家蚕和斜纹夜蛾分别有6个和5个ApoD基因;半翅目昆虫烟粉虱、褐飞虱和豌豆蚜分别有5、7和1个ApoD基因;鞘翅目昆虫马铃薯叶甲有7个ApoD基因;而二斑叶螨、柑桔全爪螨和苹果全爪螨分别有62、21和16个ApoD基因,其数量远多于哺乳动物和昆虫,暗示ApoD在叶螨中的剧烈扩张。2.叶螨ApoD表达受取食诱导基于二斑叶螨和柑桔全爪螨不同发育阶段的转录组数据,以及两种叶螨寄主转换的转录组数据,分析发现ApoD与叶螨取食的寄主植物关系密切。利用RT-q PCR技术检测两种叶螨取食甜橙和大豆幼苗时其ApoD的表达模式,结果发现,叶螨ApoD基因的表达量随着取食时间延长逐渐上调,随后趋于稳定或下调,说明ApoD与叶螨取食植物的时长有关。利用免疫组织化学技术,定位ApoD在螨体的分布,结果发现,免疫荧光信号均集中在两种叶螨的肠道附近,呈点状分布,推测为叶螨肠道的巨型消化细胞。3.叶螨ApoD参与氧化胁迫适应通过检测取食甜橙和大豆后叶螨体内过氧化脂质(LPO)含量变化,研究叶螨体内氧化压力与累积取食时长的关系。结果发现,在短时期内叶螨体内LPO的含量随取食时间逐渐上升,说明叶螨取食会引起体内过氧化脂质含量增加。利用RNAi技术,干扰二斑叶螨ApoD基因(tetur01g5730和tetur01g5740)与柑桔全爪螨ApoD基因(EVM0011211、EVM0006972、EVM0004493和Pc-newgene11497)的表达水平,观察叶螨取食的表现。结果显示,干扰柑桔全爪螨ApoD基因表达后,取食茉莉酸和水杨酸处理的叶片后产卵量下降,说明干扰ApoD基因表达降低了叶螨的寄主适应性;而干扰二斑叶螨ApoD基因表达后,其存活率、产卵率均未发生明显变化。但检测两种叶螨体内LPO含量,发现干扰后,其体内LPO水平均显著上调,表明叶螨ApoD基因在稳定体内平衡具有重要作用。此外,离体表达ApoD(tetur01g5730)后,发现其能提高氧化胁迫下的细胞存活率,具有抗氧化功能。
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