糖组学研究是继基因组学和蛋白质组学之后的一个新的生物学研究热点,其中糖蛋白质聚糖是糖组学研究的重中之重。N-糖酰胺酶(PNGase)是糖蛋白N-连接糖基化研究中主要的工具酶,其作用是将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来进行分析,被广泛用于糖链结构信息、糖链结构与功能关系、糖链对糖蛋白功能的影响以及蛋白质结构分析等方面的研究。目前广泛使用的商业化N-糖酰胺酶主要有两种:PNGase F和PNGase A,但是这两种酶在使用中都有各自不可克服的缺点,不能完全满足糖组学飞速发展的需要。因此通过进一步的挖掘和筛选,开发出不具备自身糖基修饰、能够使用原核系统进行表达、且能最大限度酶切不同糖链结构的新N-糖酰胺酶,是糖组学研究发展的必然需求。本研究从细菌Terriglobus roseus中发现了 一种编码新型N-糖酰胺酶PNGase H~+的基因,并对该基因进行了分子克隆和体外重组表达,并对重组表达的PNGase H~+的活性及酶学特性进行了研究。具体内容如下:1.本研究从酸杆菌属Terriglobtus roseus DSM 18391中发现了一种新型的N-糖酰胺酶PNGaseH~+基因,并对其进行了基因克隆。将获得的PNGase +基因连接到pET30a载体上,然后转化至E.coli BL21(DE3)中,得到含有重组PNGaseH~+质粒的工程菌。在特定的条件下对此工程菌进行了培养及诱导表达,进而通过Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化,得到了纯度较高的重组PNGaes H~+酶。2.为了确定重组蛋白的活性,本研究以商业化的PNGaseF为对照,以核心结构含有α1,3-岩藻糖的糖蛋白HRP为底物,利用超高效液相进行活性初测,证明重组蛋白具有N-糖酰胺酶A样活性。以荧光标记的糖肽GNGN为底物建立了基于超高效液相的酶活性检测方法。在对重组PNGase +酶学特性进行研究的过程中,发现重组PNGase +酶的最适pH为2.6,最适反应温度为30℃,重组PNGase H~+酶无任何金属离子依赖性,而大部分常用的表面活性剂会影响其活力。3.对重组PNGaseH扩酶的底物特异性研究显示:重组PNGase +酶既可像PNGase F 一样作用于哺乳动物来源的高甘露糖型、复合型以及杂合型N-糖链,又可如PNGase A 一样作用于植物来源具有核心α1,3-岩藻糖连接的N-糖链,并克服了 PNGase A不能直接作用于糖蛋白的缺点。此外,在作用于植物来源的糖蛋白时,其对不含有核心α1,3-岩藻糖的N-糖链的酶解效率要高于PNGase F。总而言之,PNGase H~+基因的成功克隆表达弥补了现有商业化N-糖酰胺酶的缺陷,为糖生物学研究提供了功能良好、经济工具酶。