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目的喉乳头状瘤是一种喉部良性肿瘤。成人型喉乳头状瘤单发多见、多次复发后易恶变,属喉癌前疾病之一,其恶变率较高。受病理取材部位、病理医师经验差异影响,对其恶变的早期诊断不理想。恶性肿瘤的形成是一个多因素、多步骤作用的细胞异常增生的过程。蛋白质序列中丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸键的磷酸化是控制细胞周期循环、调节细胞增殖和转化的关键信号转导机制之一。Pin1是多肽基脯氨酰顺反同分异构酶家族成员之一,主要调节有丝分裂相关蛋白酶,对细胞周期运行起着非常重要的调节作用。Pin1专一性识别并顺/反异构已磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸蛋白质,这种顺反构型转变直接影响蛋白质功能活性。CyclinD1是Ras信号转导通路上的关键分子,Pin1过表达可以使CyclinD1在细胞核内异常蓄积,导致细胞异常增殖。研究发现,在多种人类恶性肿瘤中Pin1和CyclinD1过表达,可见其在肿瘤的形成过程中发挥了重要作用。研究成人喉乳头状瘤及其恶变组织中Pin1和CyclinD1的表达对了解成人喉乳头状瘤恶变的发生和发展具有重要意义。为此,本研究检测了成人喉乳头状瘤中Pin1和CyclinD1的表达情况,分析了二者之间的相关性,探讨二者在喉乳头状瘤恶变中的作用,为喉乳头状瘤恶变早期诊断提供依据。方法1、实验材料收集中国医科大学盛京医院耳鼻喉科自1989年4月至2007年3月间手术和活检的成人喉乳头状瘤病例39例,喉乳头状瘤伴中、重度不典型增生(伴不典型增生组)27例,喉乳头状瘤伴癌变(恶变组)16例标本,共计82例,作为实验组。收集喉癌患者喉全切除术癌旁2cm正常组织10例作为对照组。2、染色方法正常喉组织标本经4%福尔马林固定,常规脱水后石蜡包埋。所有蜡块连续切片,每张切片4微米厚,一张HE染色核实诊断。采用免疫组织化学方法(S-P)染色,具体步骤按说明书。以PBS代替一抗的切片为阴性对照。3、结果判断Pin1判断的参考标准:Pin1在正常组织不表达或弱表达于胞核,过度表达时胞核胞浆均着色。(A)阳性细胞染色强度分为:无染色为0分;细胞内可见淡黄色颗粒,为1分;见棕黄色为2分;棕褐色或棕红色为3分。(B)500个细胞染色阳性细胞数分级:阳性细胞率0%为0分;1%-33%为1分;34%-66%为2分;≥67%为3分。A×B≤2分者为阴性,≥3分者为阳性表达。Cyclin D1的结果判断参考何国庆标准:以肿瘤细胞核出现淡黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞,每片随机观察5个视野,取均值,阳性细胞率＞10%为阳性。4、统计学分析方法应用SPSS11.0版统计软件进行数据处理,采用x~2检验、Fisher确切概率法、Spearman秩相关分析Pin1和Cyclin D1在各组中的表达关系及二者的相关性。P＜0.05或P＜0.0125为有统计学意义。结果1、Pin1在正常组和病变组中的表达情况Pin 1在喉正常鳞状上皮组织中不显色或仅有微弱显色(0/10);在各病变组中过表达,染色定位于胞核及胞浆。在12.82%(5/39)的喉乳头状瘤组、40.74%(11/27)的伴不典型增生组和81.25%(13/16)的恶变组中显示阳性表达。正常组与病变组的Pin1表达经Fisher确切概率检验具有统计学意义(P＜0.05);经多样本率x~2检验三组中Pin1蛋白表达阳性率不全相等(α=0.05,P＜0.05),经x~2分割法检验各组之间差异有显著性(α,=0.0125,P＜0.0125)。2、Cyclin D1在正常组和病变组中的表达情况Cvclin D1在喉正常鳞状上皮组织中不表达(0/10);在各病变组中过表达,染色定位于胞核和胞浆。其中17.95%(7/39)的喉乳头状瘤组、33.33%(9/27)的伴不典型增生组及75%(12/16)的恶变组呈阳性表达。正常组与病变组的Cyclin D1表达经Fisher确切概率检验具有统计学意义(P＜0.05);经多样本率x~2检验喉乳头状瘤组、伴中重度不典型增生组、恶变组织中Cyclin D1蛋白表达阳性率不相等(α=0.05,P＜0.05);经x~2分割法检验喉乳头状瘤组与伴不典型增生组之间表达无显著性差异(α′=0.0125,P=0.081＞0.0125),其余各组之间差异有显著性(α′=0.0125,P＜0.0125)。3、Pin1和Cyclin D1表达的相关性在Cyclin D1阳性表达的7例喉乳头状瘤组织中,有4例Pin1阳性表达。经spearman秩相关检验两者在喉乳头状瘤组的表达呈显著正相关(rs=0.620,P＜0.001)。将伴不典型增生组和恶变组合并。在Pin1阳性表达的24例两组中有17例Cyclin D1阳性表达(r_s=0.495,P＜0.05)。结论1、Pin1和CyclinD1在成人喉乳头状瘤、喉乳头状瘤伴中重不典型增生、喉乳头状瘤恶变组织中表达逐渐增强,可能在喉乳头状瘤恶变中发挥重要作用。2、Pin1和CyclinD1在成人喉乳头状瘤、中重度不典型增生和恶变组织中表达具有显著正相关性,表明Pin1上调CyclinD1表达,可能是喉乳头状瘤恶变机制之一。