在过去的五十年里,心血管外科技术取得了很大的进展,手术成功率得到了很大的提高。然而,心脏大血管手术相关的并发症以及由此导致的死亡率仍然较高。一些重症患者的手术,如复杂先天性心脏病和主动脉瘤病变累及主动脉弓部等,这些手术难度大、操作复杂,而且需要在手术过程中暂时中断脑、脊髓的正常血液供应。因阻断主动脉而导致的脊髓缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI),是严重的术后并发症,对患者的预后、生活质量和心理造成严重伤害。因此,如何防治神经系统并发症是心脏大血管手术面临的重要课题。目前,国内外对脊髓IRI的机制进行的研究表明,脊髓IRI的发生和发展有多种因素参与,包括兴奋性氨基酸、一氧化氮、自由基和脂质过氧化、胞内钙超载以及细胞凋亡等。应激反应是脊髓IRI的主要损伤机制,应激状态刺激热休克蛋白70(Heat shock protein 70,Hsp70)快速大量合成与释放。Hsp70是热休克蛋白家族(Heat shock proteins,HSPs)的重要成员之一,它参与蛋白质折叠、亚基的组成、细胞内运输以及蛋白质降解等过程,在应激反应中发挥抗氧化应激的作用。针对脊髓IRI的机制,目前认为心脏大血管手术中脊髓的保护手段除了提高手术技术、保证脊髓血供以及脑脊液引流等措施以外,NSCs移植有望成为修复中枢神经系统病变的重要疗法。传统观点认为,中枢神经损伤后神经细胞数量不可逆地减少,导致神经功能障碍难以恢复。直到1992年,Reynolds和Weiss成功从成年小鼠的纹状体发现了NSCs,这种细胞具有自我更新和分裂增殖能力,可以分化为神经系统大部分类型的细胞,对损伤和疾病具有反应能力,提示成年中枢神经系统也有自我修复能力。然而,中枢神经系统的自身修复不足以恢复神经功能。随着近年对NSCs研究的深入,越来越多的证据提示基因修饰的NSCs移植疗法有望应用于中枢神经系统损伤。神经营养因子-3(Neurotrophin-3,NT-3)能促进NSCs生存、迁移和向脊髓内具有的神经元类型分化,酪氨酸激酶C(Tyrosine kinase C, TrkC)是NT-3的高亲合力受体,负责调节NT-3的神经营养作用。NT-3通过与TrkC的胞外区结合,将神经细胞存活和分化的信号传递到细胞内部,促进NSCs分化为神经细胞。然而,由于一般的NSCs不能稳定表达足够数量的TrkC,因此通过基因修饰NSCs来增加其TrkC的表达有望提高其在受损脊髓内的存活率,促进其向各种神经细胞的分化和向远处迁移。因此,本研究拟通过转染TrkC基因制备高表达TrkC的NSCs,并移植到大鼠脊髓IRI模型中,探讨高表达TrkC的NSCs对脊髓IRI的作用及机制。本研究分两部分进行,第一部分以大鼠胎脑海马组织NSCs作为来源细胞,通过转染TrkC基因制备高表达TrkC的NSCs。第二部分建立大鼠脊髓IRI模型,将NSCs和高表达TrkC的NSCs分别移植到脊髓损伤部位,观察大鼠的后肢运动功能、脊髓组织病理改变以及血清Hsp70的改变,探讨高表达TrkC的NSCs移植对脊髓IRI的作用及可能机制。第一章：大鼠神经干细胞的培养与高表达TrkC的神经干细胞的制备目的：在体外分离、培养和鉴定大鼠NSCs,并通过转染TrkC基因制备高表达TrkC的NSCs。方法：(1)选择孕14d Wistar大鼠,取出胎鼠脑海马组织,机械消化成单细胞悬液,在含生长因子的无血清培养皿中悬浮培养,传代后使用。通过观察细胞形态鉴定NSCs。(2)通过设计和合成TrkC引物,逆转录获得cDNA,通过酶切与连接获得pMD18-T-TrkC质粒。(3)NSCs分为三组,、对照组不作处理；空载体组为转染空载体的NSCs;高表达组为使用pMD18-T-TrkC质粒转染的NSCs。(4)通过RT-PCR和Western blot检测比较三组细胞的TrkC的表达。结果：原代培养细胞均为圆形亮球状,第3d开始贴壁分化,细胞渐渐变为梭形,伸出突起；第6d出现大量神经元和神经胶质细胞,突起交织成网状。RT-PCR和Western blot检测结果提示,与对照组和空载体组相比,通过质粒转染TrkC的NSCs明显高表达TrkC。结论：大鼠胎脑海马组织能分离出NSCs,以质粒为载体、脂质体为介导可成功制备高表达TrkC的NSCs。第二章：高表达TrkC的NSCs对脊髓缺血再灌注损伤的作用及对Hsp70的影响目的：探讨高表达TrkC的NSCs移植对脊髓缺血再灌注损伤的作用及对Hsp70的影响。方法：选取45只Wistar大鼠,雌雄不拘,采用左肾静脉下阻断腹主动脉的方法构建脊髓缺血损伤模型,随机分为3组：(1)阻断组,只进行阻断腹主动脉；(2)NSCs移植组,阻断腹主动脉术后1d移植普通NSCs到受损脊髓；(3)TrkC-NSCs移植组,阻断腹主动脉术后1d移植高表达TrkC的NSCs到受损脊髓。每组于移植术后1 d、2 d、3 d、7 d及14 d分别选3只大鼠采用改良Tarlov评分进行后肢运动功能,然后收集尾静脉血进行ELISA检测Hsp70蛋白浓度,最后处死大鼠取脊髓标本,进行组织病理学检查,包括HE染色、TUNEL染色及凋亡指数计算,以及尼氏染色。计量资料组间比较采用单因素方差分析,功能评分采用非参数检验。结果：45只Wistar大鼠全部建模成果并存活。后肢运动功能评分结果显示,术后7d,TrkC-NSCs移植组评分均明显高于阻断组(P<0.05)；术后14d,NSCs移植组评分均明显高于阻断组,TrkC-NSCs移植组评分均明显高于另外两组(P均<0.05)。组织病理学结果显示,术后5个时间点中,各组大鼠脊髓组织细胞形态在术后7d时差异最为明显,阻断组脊髓神经细胞形态肿胀,大量细胞凋亡,尼氏小体减少；TrkC-NSCs移植组神经细胞及其细胞器的形态最接近正常,凋亡细胞最少；NSCs移植组神经细胞及凋亡数量介于上述两组之间。ELISA检测结果显示,各组大鼠移植术后Hsp70蛋白水平均升高,于术后3d达到峰值,TrkC-NSCs移植组各时间点的Hsp70水平均高于另外两组,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论：NSCs移植对脊髓损伤有保护作用,且高表达TrkC的NSCs的保护效果更佳,其机制可能是替代受损神经细胞,以及促进Hsp70的释放而减轻应激反应。