论文部分内容阅读
第一部分：SynaptotagminⅡ在RBL-2H3的表达、定位及在胞吐中的作用研究
目的:
1.研究SynaptotagminⅡ(简称Syt2)是否在大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3，简称RBL)中表达。
2.研究Syt2在RBL细胞中的分布。
3.研究Syt2在RBL细胞中过表达对RBL细胞胞吐的影响，分析Syt2在RBL细胞胞吐中的作用。
方法:
1.采用Westernblot检测Syt2在RBL中的表达情况。
2.用高保真酶扩增Syt2，构建pEGFP-N1-Syt2表达质粒，电穿孔转染RBL，通过G418筛选和有限稀释获得稳定表达融合蛋白Syt2-EGFP的细胞。
3.通过钙离子载体和抗原刺激，分别检测稳定转染细胞和对照细胞分泌的β-氨基已糖苷酶、5-羟色胺和组织蛋白酶D，分析Syt2对胞吐的影响。
结果:
1.Westernblot结果显示Syt2在RBL中表达。
2.构建了pEGFP-N1-Syt2质粒，插入片段测序结果与GeneBank登录号NM012665(ratSyt2)序列完全一致。经转染和筛选，获得了稳定转染细胞RBL-Syt2-S。RBL-Syt2-S不仅表达内源性Syt2，而且表达融合蛋白Syt2-EGFP。通过观察绿色荧光蛋白(GFP)在RBL-Syt2-S中的位置，得知Syt2主要位于RBL细胞的胞膜，在胞浆内仅有少量表达。
3.经刺激后，RBL-Syt2-S分泌的β-氨基已糖苷酶和5-羟色胺与对照相比无明显区别，但其分泌的组织蛋白酶D较对照减少一半，结果说明Syt2在RBL细胞中过表达抑制了RBL溶酶体胞吐。
结论:1.Syt2在RBL中表达。
2.Syt2主要在RBL细胞的胞膜上表达，在胞浆内仅有少量表达。
3.Syt2对于RBL溶酶体胞吐起负调控作用。
第二部分:反义RNA抑制synaptotagminⅡ在RBL-2H3的表达及对胞吐的作用目的研究Syt2在RBL中表达减弱对RBL细胞胞吐的影响，分析Syt2在RBL细胞胞吐中的作用。
方法:
1.用高保真酶扩增Syt2，与pEGFP-N1构建全长反义基因表达载体，电穿孔转染RBL，通过G418筛选和有限稀释获得稳定转染细胞。
2.通过钙离子载体和抗原刺激，分别检测稳定转染细胞和对照细胞分泌的β-氨基已糖苷酶、5-羟色胺和组织蛋白酶D、，分析Syt2在RBL中表达减弱对RBL细胞胞吐的影响。
结果:
1.构建了pEGFP-N1-Syt2-AS质粒，插入片段测序结果与GeneBank登录号NM012665(ratSyt2)序列完全一致。经转染和G418筛选，获得了稳定转染细胞RBL-Syt2-AS，Westernblot结果显示，两株RBL-Syt2-AS表达的Syt2均明显减少，分别只有对照的8％和10％。
2.经刺激后，RBL-Syt2-AS分泌的β-氨基已糖苷酶与对照相比明显增加，最高比对照增加3.5倍；RBL-Syt2-AS分泌的组织蛋白酶D较对照增加近1倍；但RBL-Syt2-AS分泌的5-羟色胺仅有少量增加，结果说明Syt2在RBL细胞中表达减弱促进了RBL溶酶体胞吐。
结论:
1.反义RNA明显下调了Syt2在RBL中的表达。
2.Syt2在RBL细胞中表达减弱促进了RBL溶酶体胞吐。Syt2主要对于RBL溶酶体胞吐起负调控作用。